人Alpha干擾素對靈長類動物細胞系的相對抗病毒活性，小鼠Alpha干擾素對倉鼠和大鼠細胞系的相對抗病毒活性。

Thomas B. Lavoie, Sara Crisafulli Cabatu, Jessica Esposito, Karlene Moolchan, Lara Izotova, Sidney Pestka. PBL InterferonSource, 131 Ethel Rd West, Piscataway, NJ 08854 USA.

摘要

I型IFN亞型通常具有相對的物種選擇性，這使得跨物種實驗難以解釋。敘利亞金倉鼠和挪威大鼠是常見的嚙齒動物模型，恒河猴和食蟹猴這兩種獼猴是常見的非人類靈長類動物模型，可用于多種病毒感染。來自這些物種的Alpha干擾素亞型大多不可用，因此在這些模型系統(tǒng)中經常使用小鼠或人類IFN亞型。為了了解哪些小鼠或人Alpha IFN亞型可用于跨物種實驗，我們建立了恒河猴（LLC-MK2/VSV）、蟹猴（JTC-12/EMCV）、敘利亞金倉鼠（bkh -21/VSV）和挪威大鼠（C6/VSV）細胞系的抗病毒細胞病變效應抑制實驗。在倉鼠和大鼠細胞上測試了所有14種小鼠Alpha -IFN，在恒河鼠和食蟹細胞系上測試了所有12種人類亞型Alpha -IFN。一般來說，大多數(shù)小鼠IFN - Alpha亞型在其他嚙齒動物細胞上表現(xiàn)出活性，而大多數(shù)人類IFN - Alpha亞型在獼猴細胞上表現(xiàn)出活性。然而，有幾個值得注意的例外，某些亞型在跨種分析中很少或沒有活性。本研究結果可用于鑒定和選擇最適合用于相關動物模型系統(tǒng)的人類和小鼠IFN- Alpha亞型。

介紹

哺乳動物的I型干擾素系統(tǒng)似乎是高度冗余的。這個系統(tǒng)包括各種物種的beta, epsilon, kappa, zeta 和tau。IFN-Alpha家族在大多數(shù)哺乳動物中特別大，人類有12個成員，小鼠有14個，大鼠有18個。這種冗余的原因尚不清楚，也是許多研究的主題。

倉鼠、大鼠、恒河猴和食蟹猴常被用作各種可能用干擾素治療的疾病的模型。沒有倉鼠的IFN-Alpha亞型是現(xiàn)成的，只有一個大鼠，恒河猴和食蟹的IFN-Alpha亞型是可用的。

所有的人類亞型和幾種小鼠亞型都可以在市場上買到，但關于哪些亞型可能在跨物種方式中發(fā)揮良好作用的數(shù)據(jù)很少。

我們在這些物種衍生的細胞系中檢測了多種人類和小鼠IFN-Alpha亞型的抗病毒作用，以努力了解哪些亞型可能適合特定的實驗。

方法

細胞系和病毒。小鼠成纖維細胞L929 （CCL-1）、倉鼠成纖維細胞BHK-21 （CCL-10）、大鼠成纖維細胞C6 （CCL-107）、人上皮細胞A549和恒河猴上皮細胞LLC-MK2 （CCL-7）細胞系均來自ATCC （Manassa, Va）。食蟹蟹上皮JTC-12 （JCRB0607）細胞系來自日本東京HSRRB。A549和JTC-12細胞的維持采用含10% FBS （Invitrogen）的DMEM。用10% FBS （Invitrogen）的Eagles MEM維持L929、BHK-21和LLC-MK2細胞，用10% FBS （Invitrogen）的F12K維持C6細胞。腦心肌炎病毒（VR-129B）和水皰性口炎病毒（VR-1238）也來自ATCC，并在Vero （CCL-81）中培養(yǎng)。

小鼠IFN-Alpha亞型的克隆與純化。所有Mu IFN-Alpha基因（表1）以密碼子和mRNA優(yōu)化形式合成，并在大腸桿菌中表達。它們是用熱休克促進劑系統(tǒng)表達的。包涵體中發(fā)現(xiàn)的單個IFN-Alpha成熟蛋白用胍氯變性，稀釋后重新折疊，使用色譜方法（離子交換、施膠和疏水相互作用色譜相結合）純化至bb0 95%純度（圖1）。

人類IFN-Alpha亞型均來自PBL InteferonSource庫存。

細胞病變效應試驗（CPE）。所有實驗都是通過將細胞鍍在微滴板中，使其粘附2-4小時，然后添加測試干擾素來建立的。孵育過夜后，加入EMCV或VSV的稀釋液。24-48小時后，觀察不含IFN的孔的細胞病變效應。實驗中使用的病毒原液的稀釋濃度是在時間框架內殺死90%至100%細胞的稀釋濃度的2-4倍。活細胞用結晶紫染色，并用自來水洗去多余的染料。干燥至少2小時后，用70%甲醇溶解染料，在Molecular Devices UVMax測板儀中測定562 nm處的吸光度。抑制CPE的計算方法是，將有病毒孵育但不含IFN的細胞設為100%抑制（病毒對照），將無病毒孵育的細胞設為0%抑制（細胞對照）。兩種對照均使用了6孔。通常細胞對照值是病毒對照值的6-10倍。所有樣品數(shù)據(jù)點在兩個孔中至少進行兩次獨立分析。

表1：本研究中使用的小鼠IFN基因和蛋白

NYA表示尚未提供。

圖1：純化的Mu IFN-Alpha蛋白純度為95%。

純化后的小鼠IFN-Alpha亞型（0.3 ~ 10 mg/L細菌培養(yǎng)）的表達量和產率不同。小鼠IFN-Alpha12、13、14、6T和B分別以每泳道3和1?g的濃度在12.5% SDS-PAGE上負載。

圖2：EMCV攻毒L929細胞的標準CPE試驗

PBL實驗室標準品（Mu IFN-Alpha a）已被校準為NIH小鼠IFN-Alpha標準品（Ga02-901-511）。

圖3：小鼠IFN-Alpha12、小鼠IFN-Alpha14和大鼠IFN-Alpha1對VSV侵襲大鼠C6細胞的保護作用。

大鼠Alpha 1 IFN（pbl# 13100）對VSV攻擊的大鼠C6細胞的抗病毒活性與小鼠Alpha 12和14進行了比較。

圖4：小鼠IFN-Alpha6T、小鼠IFN-Alpha13和人IFN-Alpha2a對敘利亞金倉鼠BHK-21細胞VSV攻擊的保護作用

圖5：不同實驗小鼠IFN-Alpha亞型活性的比較

表2：小鼠IFN-Alpha蛋白對L929、C6和BHK-21細胞抗病毒活性的比較

在小鼠L929細胞上，小鼠IFN-Alpha 8、9、12、14和B的活性最高。在大鼠C6細胞中，IFN-Alpha 8、11、13的活性最高；在倉鼠BHK-21細胞中，IFN-Alpha 6T、7、9、14和B的活性最高。

總的來說，小鼠IFN-Alpha 1,13,14和B表現(xiàn)出最好的跨物種反應性。因此，這些將是跨物種研究的選擇。

表3：本研究中使用的人類IFN基因和蛋白質

圖6：選定的人IFN-Alpha亞型對A549細胞的活性 

圖7：選定的人IFN-Alpha亞型在恒河猴LLC-MK2細胞上的活性

圖8：人、恒河猴和食蟹干擾素Alpha序列的關系

圖9：人IFN-Alpha亞型在人和猴細胞上活性的比較

表4：人IFN-Alpha蛋白對人、恒河猴和食蟹細胞抗病毒活性的比較

人類IFN-Alpha2、5和10似乎在細胞系中具有一致的活性。IFN-Alpha1對猴細胞有較高的活性。

結論

我們已經檢測了小鼠和人類IFN-Alpha亞型保護異源細胞免受病毒攻擊的能力。

一些亞型在物種之間表現(xiàn)出非常明顯的缺乏交叉反應性。

IFN-Alpha A是最容易獲得的小鼠IFN-Alpha亞型，對大鼠和敘利亞金倉鼠細胞的活性相對較低。

小鼠IFN-Alpha 5、9和12對大鼠細胞的活性較弱，而至少9和12對倉鼠細胞的活性較好。

人IFN-Alpha4a、4b、6和7對恒河猴細胞的活性較弱，而對食蟹細胞的活性較好。

一些IFN-Alpha亞型確實適合于涉及多物種的實驗工作。

小鼠IFN-Alpha1和IFN-Alpha 11具有良好的跨種活性。

人類IFN-Alpha2、5和10在被試物種中具有良好的反應性，尤其是IFN-Alpha10對所有被試細胞都具有非常強的活性。

這一結果有些有趣，因為恒河猴和食蟹猴的基因組都不包含與人類IFN-Alpha10序列明確同源的基因。