作者： Alok Pandey，博士，PBL Assay Science公司生物標志物與轉化科學副總裁

在使用ELISA試劑盒檢測蛋白質生物標志物時，PBL Assay Science公司反復觀察到的一個現(xiàn)象是，并非所有檢測都是同等有效的。基于我們在ELISA設計、制造以及為客戶驗證和運行第三方ELISA方面的30多年經(jīng)驗，我們發(fā)現(xiàn)了在檢測設計、性能和特性化方面存在的一些常見關注點，包括：

設計未充分考慮目標分析物的生物變異性：例如，某些分析物以不同的異構體形式存在或作為分子復合物的一部分，而許多檢測并未優(yōu)化以檢測這些形式。

定量靈敏度不足：理想的ELISA應能準確量化健康供體樣本中低濃度的分析物，以提供與疾病狀態(tài)樣本進行比較的基線。

在存在常見干擾物時的定量不準確：健康和疾病狀態(tài)樣本中的生物化合物可能會人為地降低信號，如果檢測未針對這些干擾物進行優(yōu)化。

檢測規(guī)格不完整：ELISA規(guī)格應詳細說明檢測范圍和定量下限（LLOQ），即分析物能被可靠量化的最低濃度。根據(jù)當前的ICH M10生物分析驗證指南，LLOQ必須大于或等于校準曲線中的最低點。一些制造商未能以展示可靠和一致性能的方式驗證其檢測，且許多制造商未指定LLOQ，導致數(shù)據(jù)解釋的不一致性。

PBL在ELISA產品設計中解決的四個挑戰(zhàn)示例：

VeriKine-HS人IL-15 ELISA試劑盒（產品貨號#41702）

大多數(shù)ELISA僅測量游離的IL-15或大腸桿菌表達的IL-15，而PBL設計的IL-15試劑盒能夠檢測游離的IL-15和IL-15/IL-15Rα復合物——這是人血液中的主要形式。該試劑盒旨在檢測健康供體血清和血漿中的基礎內源性總IL-15和IL-15/IL-15Rα復合物。在測試的健康供體血清樣本中，100%的樣本顯示IL-15的量高于定量下限。

圖1：IL-15/ IL15Ra配合物標準品的檢測。IL15/IL15Ra標準檢測不良（競爭者B）或根本未檢測到（競爭者A和C）。

VeriKine-HS人IFN-Alpha全亞型ELISA試劑盒（產品貨號#41115和#41135）

盡管許多研究人員認識到存在12種人類IFN-alpha蛋白亞型，但市場上的大多數(shù)檢測并未在健康供體和疾病患者中檢測到全部亞型，導致定量不準確。PBL的試劑盒旨在檢測所有人類IFN-alpha亞型，并已通過各種疾病狀態(tài)血清樣本測試，以盡量減少假陽性和假陰性結果。該產品的高靈敏度（比其他ELISA高10倍）特別適用于區(qū)分人類樣本中常見的較低水平的干擾素。

圖2：仙臺病毒時間過程中內源性干擾素α水平的定量測定

VeriKine-HS人IL-22 ELISA試劑盒（產品貨號#41701）

由于IL-22結合蛋白（IL-22BP）的干擾，許多ELISA難以準確測量生物樣本中的游離IL-22，且許多檢測無法測量健康供體和疾病狀態(tài)樣本中通常存在的低濃度IL-22。PBL設計的ELISA能夠有效地在低濃度下量化游離IL-22，確保在健康供體和疾病狀態(tài)樣本中的準確測量。

*競爭對手A列出的ELISA“靈敏度”為5.8 pg/mL，我們將其解釋為檢測下限（LLOD）。沒有提供檢測上限（LLOQ）。

表1：PBL與競品ELISA試劑盒的比較

VeriKine-HS人IFN-Beta ELISA試劑盒（產品貨號#41415和#41435）

大多數(shù)ELISA無法測量健康供體和疾病患者中低水平的IFN-beta。此外，如果檢測不測量與sIFNAR2（一種常存在于現(xiàn)實世界樣本中的受體組分）結合的IFN-beta，則ELISA結果可能會人為降低。PBL設計的ELISA能夠準確量化pg/ml水平的內源性干擾素，并能在sIFNAR2存在的情況下進行定量。該檢測還量化了在大腸桿菌和CHO細胞中表達的治療性IFN-beta分子，并已通過CRO驗證，可用于自身免疫病血清和商標IFN-beta治療藥物的定量。

圖3：PBL的檢測結果與血清樣品一致，不受sIFNAR2存在的影響。

原文鏈接如下：https://signals.cytokinesociety.org/2024/09/30/elisa-kits-and-real-world-challenges/