介紹

側(cè)流免疫層析（lateral flow immunochromatography assay，LFIA；也簡稱為側(cè)向?qū)游觯┦且环N基于抗原、抗體免疫反應(yīng)的經(jīng)典床旁檢測技術(shù)（point of care testing，POCT）。側(cè)流免疫層析試紙條，是一種在不使用實驗室設(shè)備的情況下確認(rèn)目標(biāo)分析物是否存在的簡易便攜裝置，作為是一種低成本、直接的方法，被廣泛應(yīng)用于檢測人類和動物的感染或生物標(biāo)志物，以及水、食物和動物飼料中的污染物和有害物質(zhì)。

側(cè)流免疫層析常見形式

側(cè)流免疫層析的3種常見形式：直接法（圖1）、夾心法（圖2）和競爭法（圖3）。每個測試都是以線性條帶形式運(yùn)行的，由分離和檢測感興趣的分析物所需的材料制成，并提供一個對照反應(yīng)以確認(rèn)測試的正確進(jìn)行。下面的例子概述了側(cè)流免疫層析的基本原理，并簡要地強(qiáng)調(diào)了條帶的組成部分和它們的功能。

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關(guān)鍵試劑

抗體 - 親和力和特異性

選擇正確的抗體是開發(fā)成功的側(cè)向流動免疫測定法的關(guān)鍵因素。

“如果沒有認(rèn)真測試篩選合適的抗體，那么再多的優(yōu)化都無法克服這種固有的缺陷”（Brown，2008 年）

親和力

親和力特別重要，因為抗原的相對豐度可能很低。由于抗原、抗體偶聯(lián)物和包被的抗體在測試條的分析區(qū)域中相互作用僅幾秒鐘，因此需要快速的 k_on速率和慢的 k_off速率。

特異性

抗體必須能特異性地識別目標(biāo)抗原，而不能檢測類似或同源的蛋白質(zhì)和分子。由于在LFIA測試中使用了高濃度的抗體（通常比ELISA板孔中的抗體濃度高25-100倍），出色的特異性也是至關(guān)重要的。膠體金抗體偶聯(lián)物通常以每次30-250ng的量被使用。如果假設(shè)樣品在10-50ul內(nèi)使標(biāo)記的抗體再水化，那么抗體結(jié)合物的濃度將在0.6到20ug/ml之間。在較高的濃度下，抗體可能是其Kd的100倍，這可能會促使結(jié)合力弱、特異性低的抗體產(chǎn)生非特異性的相互作用，從而導(dǎo)致假陽性。

抗體供應(yīng)

LFIA 的抗體可以在內(nèi)部制造或從商業(yè)來源購買。

數(shù)量

首先要考慮的因素之一是啟動和維持商業(yè)產(chǎn)品所需的數(shù)量。如果每條帶 1ug 的捕獲抗體并希望制作 100 萬條，則所需的抗體量至少為 1g。因此，確保供應(yīng)商能夠以一致的質(zhì)量生產(chǎn)大批量產(chǎn)品至關(guān)重要。如果要在內(nèi)部制造抗體，則必須注意選擇合適的抗原、免疫方法、篩選策略和放大工藝。

克隆性

單克隆抗體

單克隆抗體 (MAb) 的開發(fā)和生產(chǎn)是獲得具有所需屬性和保證質(zhì)量穩(wěn)定的抗體的有效方法。然而，在體外條件下的放大可能會很昂貴，并且在純化運(yùn)行之間可能會出現(xiàn)批次間的差異。篩選單克隆抗體以識別那些在膜結(jié)合、標(biāo)記和與最終測定中使用的其他抗體一起表現(xiàn)良好的單克隆抗體也很重要。抗體在與膜結(jié)合時作為捕獲劑工作良好，但在與報告分子結(jié)合時表現(xiàn)不佳的情況并不少見。最后，篩選還必須識別在實驗條件下識別檢測形式中表位的抗體，例如緩沖液成分或抗原的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。

多克隆抗體

多克隆抗體 (PAb) 的生產(chǎn)很容易擴(kuò)大規(guī)模，無論是使用兔子、山羊、雞還是驢作為宿主動物。PAb 的另一個優(yōu)點是它們也可用于實現(xiàn)更高的檢測靈敏度。作為IgG的混合物，每種IgG同時和組合識別抗原上的不同表位，它們允許沉積更多的報告分子，從而增加信號。PAb 可能存在批次間差異，但由于它們是由宿主動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的，可能會隨著時間而改變。

驗證

無論來源或制造方法如何，都需要使用相應(yīng)的工作流程來檢驗，以確保測試的一致性和可重復(fù)性。

對照線/質(zhì)控線—抗體（Control Reagents）

雖然開發(fā)或選擇合適的捕獲和檢測抗體對檢測的性能至關(guān)重要，但在LFIA中使用的控制試劑的選擇也很重要。與報告分子偶聯(lián)的IgG或二抗通常被用來設(shè)置必要的對照線/質(zhì)控線，以確保測試的正確可信。例如，陽性對照線可以用抗雞的二級抗體，該抗體與偶聯(lián)的雞IgY結(jié)合。雞IgY經(jīng)常被使用，因為與哺乳動物IgG相比，雞IgG的同源性和序列特征較低，因此產(chǎn)生的非特異性相互作用較少。對照線抗體也應(yīng)該與LFIA中使用的其他抗體有最小的交叉反應(yīng)，因為如果測試中使用的IgG或樣品中存在的IgG干擾了對照試劑的結(jié)合，那么對照線的強(qiáng)度就會有很大的變化。

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常見抗雞二抗預(yù)覽：

用于血清學(xué)測試的捕獲抗體和檢測抗體

血清學(xué)LFIA，使用抗體來捕獲或檢測由患者免疫反應(yīng)產(chǎn)生的IgG。在血清學(xué)LFIAs中，檢測線是涂有抗原的，而病人的樣本中含有特定同型的抗原IgG，通過與病人血液中的IgG結(jié)合，而產(chǎn)生信號，該抗體與檢測線上的抗原相結(jié)合（見圖1）。檢測抗體的特異性很關(guān)鍵，它不應(yīng)該與檢測中使用的其他物種的抗體或其他同種型的抗體結(jié)合。例如，在獨(dú)立檢測IgG和IgM同種型的檢測中，抗IgG抗體不能與IgM發(fā)生交叉反應(yīng)，而抗IgM抗體不能檢測IgG。

報告分子與偶聯(lián)物

常用于側(cè)流免疫層析的報告分子包括膠體金、乳膠珠和熒光染料。每種選擇都有明顯的優(yōu)勢，選擇取決于檢測目標(biāo)和檢測讀出方法。其他標(biāo)簽包括順磁顆粒、酶、量子點、纖維素納米珠、納米金、二氧化硅納米顆粒、生物發(fā)光和發(fā)光材料，以及上轉(zhuǎn)換熒光劑（Goryacheva等，2013，Quesada-González & Merko?i，2015，和（Guo等，2021）。在此閱讀更多關(guān)于報告分子與偶聯(lián)物的信息。

膠體金（Colloidal Gold）

膠體金是一種廣泛用于LFIA的偶聯(lián)物，因為它能產(chǎn)生強(qiáng)烈的顏色，易于偶聯(lián)，并且它的質(zhì)量穩(wěn)定。典型的尺寸在40-80nm之間，其中40nm是最常見的。

金顆粒與抗體的結(jié)合通常是通過靜電和疏水的相互作用被動進(jìn)行的。這兩個實體在低離子強(qiáng)度的緩沖液中混合，然后用多元醇或蛋白質(zhì)如白蛋白或酪蛋白進(jìn)行封閉。膠體金也有活化的表面，如羧基，允許在必要時進(jìn)行共價連接。

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乳膠微粒

乳膠顆粒用途廣泛，自其最初開發(fā)以來一直被用于側(cè)向流檢測。顆粒可以裝載彩色和/或熒光染料、順磁顆粒和其他化學(xué)品。不同顏色的染料可以進(jìn)行多種同時讀出的檢測。用于LFIA的標(biāo)準(zhǔn)尺寸范圍為100-300um。綴合方法在吸附或共價連接之間變化，取決于表面化學(xué)。乳膠珠的敏感度可能低于膠體金，因為它們的大尺寸使它們不能密集地包裝在測試或控制線上。

熒光染料

熒光染料作為標(biāo)簽得到了青睞；作為小分子（<1nm），它們比較大的納米顆粒更容易從偶聯(lián)墊中釋放出來。染料有助于通過一個LFIA設(shè)備對多種分析物進(jìn)行定量和檢測（Wild，2016），盡管它們需要使用特殊的閱讀設(shè)備來顯示結(jié)果并充分利用染料的特性。適用于LFIAs的熒光團(tuán)應(yīng)該是經(jīng)濟(jì)的，具有長斯托克斯位移，良好的量子產(chǎn)率，并且是光穩(wěn)定的。染料有多種形式，便于與蛋白質(zhì)和小分子上的伯胺和巰基共價偶聯(lián)。熒光素Fluorescein 和Cyanine染料是流行的選擇。

一些染料可能不適合用于LFIA，因為在高濃度下會出現(xiàn)光漂白或淬滅。結(jié)合活性可能會因為發(fā)生在抗體副體或目標(biāo)表位的關(guān)鍵點上的共價偶聯(lián)而受到影響，或者因為疏水性染料引起的聚集。

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經(jīng)典側(cè)流免疫層析分析的構(gòu)建

任何LFIA的成功也取決于其材料成分，（圖4），制造商通常使用不同的專有方法和試劑進(jìn)行生產(chǎn)。出于這個原因，應(yīng)該對來自不同來源的材料進(jìn)行評估，以確保開發(fā)出準(zhǔn)確和可靠的測試。測試優(yōu)化是一個反復(fù)的過程，可能需要幾個月才能完成。下文簡要介紹了每個組成部分，并考慮了它們在生產(chǎn)有效的LFIA中的重要性。

圖4

樣品墊

LFIA的第一步是通過樣品墊將樣品引入設(shè)備（圖4）。樣品墊材料的選擇取決于標(biāo)本的性質(zhì)和被檢測的分析物。樣品墊能分離過濾樣品中的雜質(zhì)，對樣品進(jìn)行前處理，平衡待測試樣品的PH和調(diào)整鹽離子強(qiáng)度，使樣品在層析過程中保持一定的均一性和可控性。樣品墊的材料主要選擇玻纖、無紡布和濾紙。

偶聯(lián)墊（結(jié)合墊）

樣品中自由流動的物質(zhì)從樣品墊遷移到偶聯(lián)墊。偶聯(lián)墊是抗體和其他蛋白質(zhì)或與報告分子（如膠體金、彩色乳膠顆粒或熒光染料）附著的載體。可以添加額外的成分，如糖類，以確保干燥的浸漬試劑在環(huán)境溫度下的穩(wěn)定性，并延長保質(zhì)期。當(dāng)樣品移入偶聯(lián)墊時，偶聯(lián)物被重新水化并與樣品成分相互作用。然后它們移到膜上，膜稍微重疊。偶聯(lián)墊通常由玻璃纖維、聚酯纖維或人造纖維制成。

膜

試劑-樣品混合物通過膜遷移，免疫測定完成并可視化。 LFIA 中使用的膜會影響靈敏度、速度和整體背景（Huang 等人，2016 年和 Wild & Mansfield，2016 年）。 更快的流速可以降低背景，但會影響靈敏度，導(dǎo)致假陰性。 當(dāng)由于分析物駐留時間增加而需要高靈敏度時，使用較慢的芯吸速率。 緩慢的芯吸速率可能會導(dǎo)致假陽性信號，因為不充分特異性的抗體會導(dǎo)致較高的背景。

硝酸纖維素膜（NC膜）因其高蛋白質(zhì)結(jié)合能力和廣泛的可用性而被普遍使用。 膜制造商添加專有的表面活性劑、潤濕劑和其他化學(xué)品來控制蛋白質(zhì)結(jié)合和芯吸速率，從而實現(xiàn)一致的分析性能。

膜的干燥與封閉

應(yīng)用在硝酸纖維素膜上的抗體通過親水相互作用在接觸時結(jié)合。抗體在應(yīng)用點上結(jié)合，而不會隨緩沖液擴(kuò)散。涂抹抗體后，水在40°C的強(qiáng)制空氣下?lián)]發(fā)，抗體通過疏水作用固化在膜上。如果需要的話，膜的封閉通過浸泡在封閉緩沖液中，然后再進(jìn)行干燥。有效的干燥對LFIA的性能至關(guān)重要，因為它確保了生物分子的穩(wěn)定性和均勻的再濕潤。包被的材料應(yīng)在精心控制的溫度和約20%濕度下儲存。

吸水墊

位于側(cè)流試紙條遠(yuǎn)端的吸水墊，將硝化纖維膜上的載液/緩沖液從測試線和對照線吸到試紙條的末端。樣品和偶聯(lián)物繼續(xù)被吸入測試條，直到?jīng)]有更多的液體可以被吸走，或者吸液墊變得飽和。高密度纖維素常被用于此目的。

將試劑應(yīng)用到 LFIA 設(shè)備的組件上

為了確保LFIA的可預(yù)測和可重復(fù)性，抗體、抗原、緩沖鹽和結(jié)合物應(yīng)該以統(tǒng)一和可重復(fù)的方式應(yīng)用到膜或墊上。根據(jù)包被材料，或開發(fā)或制造過程的階段，可以使用各種方法。LFIA制造需要能夠產(chǎn)生一致的流動特性的設(shè)備和能夠?qū)崿F(xiàn)高產(chǎn)量的應(yīng)用方法。

浸沒

通過將墊浸入含有這些成分的溶液中，然后吸干和干燥緩沖劑、封閉劑和偶聯(lián)物等材料。

Tips: 將抗體和蛋白質(zhì)應(yīng)用于膜或偶聯(lián)墊需要更高的精度，以獲得生產(chǎn)批次之間的均勻性；因此，專門的點膠設(shè)備是必要的。

氣動接觸分液器

氣動接觸分液器通過泵送材料，使材料通過與膜或偶聯(lián)墊接觸的柔性點膠頭，來分液。點膠頭和膜的相對移動，沿著材料形成一條均勻的試劑線。接觸式分液器通常很經(jīng)濟(jì)，而且可以在小空間內(nèi)容納。然而，它們會損壞膜，而且在大規(guī)模的生產(chǎn)操作中可能難以控制。因此，它們通常在研究和開發(fā)過程中使用，在這種情況下，需要低量的條狀物來進(jìn)行檢測優(yōu)化。

非接觸式噴點器

非接觸式噴點設(shè)備，如噴筆或噴墨液滴噴點器，利用高精度的泵來輸送低至1nL大小的液滴，可以形成小至200um寬的線條/條紋。強(qiáng)制空氣也可以被引入，以達(dá)到類似于藝術(shù)家的噴筆噴霧的效果。這兩種非接觸方法都可以分配試劑，其CV值或優(yōu)于+/-1%，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。

試紙條組裝

LFIA的材料成分被層壓在一個涂有粘合劑的柔性塑料背板上，以提供硬度，從而使測試條能夠被輕易地處理。在每個材料的接口處有足夠的重疊，最小為2毫米，這是必要的，這樣樣品液體就可以從一個部分無縫地流向另一個部分。當(dāng)材料被應(yīng)用到背板上時，要使用均勻的壓力以確保樣品沿著測試條均勻地流動。這個 "卡片 "組裝好后，條狀物被切割成大約5mm的一致寬度。然后，測試條可以被放入精心設(shè)計和成型的塑料外殼中，以確保使用者在正確的區(qū)域加入樣品，并實現(xiàn)適當(dāng)?shù)牧鲃印Ｋ芰贤鈿ぶ羞€包括一個帶有適當(dāng)標(biāo)記的窗口，以方便結(jié)果的正確讀取。

半條測試

測試條不需要與樣品或結(jié)合物墊一起組裝。以這種方式構(gòu)建的試紙條通常被稱為 "半條"。它們通常在開發(fā)過程中用于篩選抗體、偶聯(lián)物和其他試劑。在試管或96孔板中混合少量的樣品和報告偶聯(lián)物，例如50uL，然后將半條帶的自由膜端放入溶液中。混合物在毛細(xì)作用下沿著條帶向上遷移，最終到達(dá)吸水墊。該條帶可以被移除并讀取，或者轉(zhuǎn)移到含有其他溶液的試管中，這些溶液被抽吸起來，直到吸水墊飽和。

在介紹了側(cè)流免疫分析的形式和結(jié)構(gòu)后，下面將介紹一個簡單的檢測人IgG和IgM的開發(fā)實例。

開發(fā)用于人IgG檢測的側(cè)流免疫

血清學(xué)檢測能夠?qū)膊∵M(jìn)行監(jiān)測，從最初的感染一直到免疫力的產(chǎn)生。血清學(xué)檢驗的是對病人體內(nèi)抗體的特異性檢測。側(cè)流免疫分析法被廣泛用于檢測人類IgG。在這里，我們展示了Jackson ImmunoResearch公司的抗人類同種型特異性抗體在LFIA格式中的效用。

摘要

構(gòu)建了一個基于半條形側(cè)流免疫層析實驗的雙抗夾心法，專門檢測人血清中的人IgG與IgM。需要設(shè)置對照線，以確保測試的正確進(jìn)行。下圖（圖5）表示了檢測的設(shè)置和指示陽性檢測的交互作用。

關(guān)鍵檢測試劑

陽性對照

試劑使用

抗體被涂在Whatman FF170HP硝酸纖維素膜上，以產(chǎn)生反映典型LFIA流動特征的條帶。捕獲抗體在PBS中稀釋至0.3mg/ml，并以60ul/min的速度連續(xù)分配到以10mm/s速度移動的膜上。通過使用注射泵，通過與膜直接接觸的PEEK管來控制分配速度。剝離后，膜在40°C強(qiáng)制空氣下干燥，然后將膜浸入1%的BSA在PBS中的溶液中封閉1小時，接著清洗，然后在40°C強(qiáng)制空氣下干燥過夜。

LFIA半條帶組裝

干燥后，將膜貼在自粘性底板上，并加入纖維素吸水墊（Ahlstrom 222級），與硝酸纖維素膜重疊約2mm。膜被切割成0.5cm的單獨(dú)條帶，在使用前被放置在含有干燥劑的干燥器中至少48小時。

方法概述

捕獲抗體在硝酸纖維素NC膜進(jìn)行條帶化，得到每線性cm含有 0.3ug 抗體的線：

IgG 測試線：山羊抗人 IgG，F(xiàn)cγ 片段特異性（min X Bov，Ms，Rb Sr Prot）(109-005-170) ；

IgM 測試線：山羊抗人 IgM，F(xiàn)c5u 片段特異性 (min X Bov Sr Prot) (109-005-129) ；

對照測試線：驢抗雞 IgY (IgG) (H+L) (min X Bov , Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat, Shp Sr Prot) (709-005-155)。

用 PBS 中的 1% 牛血清白蛋白（無 IgG，無蛋白酶）(001-000-162) 封閉膜，然后干燥并應(yīng)用芯吸墊。

將側(cè)向流動測試條置于 50 ul 混合物中，其中包含檢測抗體：40 nm 金偶聯(lián)物，0.8 OD520/ml ChromPure 雞 IgY (IgG)-全分子 (003-400-003)、山羊抗人 IgM、Fc5u片段特異性 (min X Bov Sr Prot) (109-405-129) 和山羊抗人 IgG, Fcγ 片段特異性 (min X Bov, Hrs, Ms Sr Prot) (109-405-098)。

其他孔也加入了 50 ng 純化的人IgG：ChromPure 人 IgG，全分子 (009-000-003) 和 ChromPure 人 IgM（myeloma），全分子 (009-000-012) 或使用PBS 1:200稀釋的人血清。運(yùn)行測試 15 分鐘后，將試紙轉(zhuǎn)移到含有 PBS 的孔中以去除多余的金結(jié)合物。

結(jié)果

用于側(cè)向流檢測的抗人類多克隆抗體

圖5

所有的測試都是在96孔板中進(jìn)行的，時間不到20分鐘。試劑的濃度和其他參數(shù)需要優(yōu)化。這些參數(shù)包括：捕獲抗體、檢測偶聯(lián)物、測定緩沖液條件以及需要封閉膜。最終條件詳見方法概要。

捕獲抗體和檢測抗體產(chǎn)生了強(qiáng)烈的陽性測試線，表明在人血清存在的情況下檢測特定的IgG同種型。雖然這里沒有顯示，但在這種形式下也能檢測到亞ng的人類IgG。

然而，使用純?nèi)搜宕_實產(chǎn)生了 "HOOK效應(yīng)"，導(dǎo)致樣品在血清中的濃度越高，信號就越少，因此在使用前必須將血清在PBS中稀釋1: 200。通過使用大量的金結(jié)合物可以避免稀釋，但這可能會導(dǎo)致結(jié)果解釋上的困難，并且需要追隨緩沖液清洗步驟來幫助分析。本實驗中包括一個洗膜步驟以提高清晰度。

在生理條件下用BSA封閉和用Tween 20緩沖，改善了樣品的流動性。纖維素吸水墊非常有效，如果長時間放置，可使整個樣品被吸走。

這個簡短的案例研究表明，Jackson抗體適用于檢測人血清中的特定IgG同種型，證明它們適合用于POCT檢測中側(cè)流免疫層析產(chǎn)品的開發(fā)。

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參考：

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* 本文自Jackson官網(wǎng)專欄漢化，英文原文可聯(lián)系艾美捷客服索取

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