GlycoSense?是一種使用雙激光流式細胞儀檢測糖蛋白上糖基化模式的多重檢測方法。GlycoSense?陣列由結合到多重微球（珠子）上的凝集素組成，這些凝集素能夠結合糖蛋白上的末端單糖，從而快速分析存在的糖特征。這種簡化的“GlycoPrint”雖然不能提供完整的糖基化譜或結構信息，但能夠檢測到幾個關鍵糖特征的變化。這個陣列中的微球已經(jīng)被評估過，能夠結合N-連接糖上的唾液酸、半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）。GlycoSense?珠子可以用633/640納米激光激發(fā)，并可以在常規(guī)流式細胞儀的APC、APC-Cy7或FL4熒光通道上進行測量。GlycoSense?檢測需要對糖蛋白或檢測糖蛋白的試劑（如結合伴侶或Fab片段）進行直接標記，使用488納米激發(fā)的熒光團（例如，Alexa Fluor? 488、DyLight? 488、FITC、SureLight? 488）。也可以直接檢測（例如，GFP）標記的重組糖蛋白。不推薦使用完整的抗體進行糖蛋白的二次檢測，因為抗體的糖基化可能會干擾檢測。

艾美捷GlycoSense糖鏈分譜試劑盒（LTZ-GK0101-50UL）使用說明：

1. 在含有1 mg/mL牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS/BSA）中準備一份標記或未標記的糖蛋白樣品。樣品中糖蛋白的濃度應介于0.5-5μM之間，以0.5-2μM為zui佳。（抗體濃度在0.5-1μM之間為zui佳。）也可以檢測未知濃度的非糖蛋白，但如果超過5μM可能會導致背景信號過高。按照試劑盒中的方法，將標記的胎蛋白和去糖胎蛋白對照樣品制備成1μM的濃度。檢測體積可以是50-1000μL，對于大多數(shù)市售的流式細胞儀來說，100μL為zui佳體積。也可以使用其他緩沖液和無血清培養(yǎng)基進行GlycoSense?檢測，但結果可能會有所不同。

2. 在使用前徹底振蕩混勻珠子。向糖蛋白樣品中加入1μL（約10,000個微球）的每種GlycoSense?珠子#。在避光的條件下，在室溫下使用低速至中速旋轉或振蕩設備孵育1小時。胎蛋白和去糖胎蛋白對照樣品直接用染料標記，不需要二次標記步驟。如果分析未標記的糖蛋白，在孵育后離心下來，去除上清液，并在避光的條件下與標記的二抗試劑（例如，100μL的1μM抗糖蛋白Fab片段）孵育30-60分鐘。較長的孵育時間會導致信號增強，但背景也會增高。如果需要將兩個或更多檢測的結果進行直接比較，孵育時間應保持一致。（可選：為了減少背景和非特異性結合，在與染料標記的蛋白孵育后離心下來，去除上清液，并在PBS/BSA中重新懸浮珠子。）

3. 創(chuàng)建一個雙變量前向和側向散射（FSC/SSC）點圖。將Gating Beads稀釋至1:10的PBS/BSA中。在流式細胞儀上以慢速運行2-3分鐘。門控整個微球總體群。稀釋后的珠子可以丟棄或保存在4°C下以備將來使用。

4. 在散射門控的微球上創(chuàng)建一個紅色熒光通道直方圖（例如APC或FL4），以區(qū)分個別峰#。調(diào)整PMT設置以適應直方圖中的所有峰，如有必要。在紅色熒光直方圖中門控個別峰#。為每個珠子峰#創(chuàng)建一個綠色熒光通道直方圖（例如FITC或FL1）。

5. 完成步驟2中的結合孵育后，以慢速在流式細胞儀上運行樣品。調(diào)整綠色通道的PMT設置，使zui高值在直方圖的范圍內(nèi)，如有必要。收集至少1,000個事件對應于每個珠子#。

6.記錄綠色通道中每個峰#的中位熒光強度，可以直接從流式細胞儀軟件中讀取，或使用數(shù)據(jù)分析程序。

GlycoSense 糖鏈分譜試劑盒數(shù)據(jù)分析：

在每個珠子#收集至少1,000個事件之后，可以直接從流式細胞儀軟件中記錄每個峰的中位FL1值，或者使用流式細胞數(shù)據(jù)分析程序獲取，然后使用Excel等程序進行繪圖。由于BSA珠子代表的是背景熒光，并且會依賴于樣品（非特異性結合以及流式系統(tǒng)中的染料或熒光蛋白），所以可以從其他值中減去BSA珠子的讀數(shù)。背景熒光在不同樣品之間會有輕微的變化，因為蛋白質可能具有不同的熒光團與蛋白（F/P）比率。試劑盒中包含的胎蛋白和去糖胎蛋白的F/P比率是相似的。

下圖展示了1μM SureLight? 488標記的胎蛋白和去糖胎蛋白與五種GlycoSense?珠子#結合1小時后的代表性“GlycoPrint”（Excel圖表）。使用BD Accuri C6流式細胞儀記錄了中位FL1熒光值。三個獨立樣品值的平均值被繪制成圖，并以標準差作為誤差條。數(shù)據(jù)表明胎蛋白上存在α2,6-和α2,3-連接的唾液酸，這是通過更高的SNA和MAL I信號顯示出來的，而通過更高的ECA信號可以看出去糖胎蛋白具有更多的末端半乳糖。

圖：SureLight?488標記的糖蛋白與GlycoSense?珠結合的比較

注：使用GlycoSense?觀察到的熒光值是定性的。每種凝集素或捕獲試劑對其特定聚糖靶標具有不同的親和力，并且每個微球可能具有不同數(shù)量的偶聯(lián)有效分子。GlycoSense?可以監(jiān)測相關樣品的聚糖特征變化或糖基化差異。