LifeSensors的PROTAC檢測(cè)板試劑盒用于泛素化的相對(duì)測(cè)定PROTAC處理后細(xì)胞裂解物中靶蛋白的表達(dá)。此檢測(cè)旨在取代更費(fèi)力的半定量蛋白質(zhì)印跡方法來(lái)檢測(cè)多泛素化和靶蛋白在細(xì)胞中的降解，并提供定量和可重復(fù)的結(jié)果。此外，該測(cè)定允許高通量篩選以處理化合物文庫(kù)和建立秩序效價(jià)幫助化學(xué)家建立SAR。這塊板是為研究而設(shè)計(jì)的僅使用，不用于人類或動(dòng)物的診斷或治療應(yīng)用。

艾美捷PROTAC檢測(cè)板試劑盒#LSS-PA-0950-0096檢測(cè)原理：

Assay Plate是一種基于三明治的檢測(cè)方法，其中來(lái)自細(xì)胞裂解物被捕獲在預(yù)涂微量滴定板的孔中，使用專有的多泛素結(jié)合試劑。未被多泛素化/未結(jié)合的蛋白質(zhì)通過(guò)洗滌，然后加入針對(duì)靶蛋白的抗體，然后洗滌。最后，使用與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的第二抗體來(lái)測(cè)量

結(jié)合的目標(biāo)抗體與檢測(cè)試劑和發(fā)光微孔板讀取器。

PROTAC檢測(cè)板試劑盒組件：

涂層板： 一個(gè)預(yù)包被和封閉的 96 孔試紙 PROTAC 檢測(cè)板（儲(chǔ)存在 -80°C)

封閉濃縮物（BC）： 12 mL 用于抗體稀釋的 5X 封閉劑（儲(chǔ)存在 4°C)

塑料板密封： 雙板密封

檢測(cè)試劑 1 （DR1）： 1.0 mL DR1 試劑瓶（儲(chǔ)存在 4°C)

檢測(cè)試劑 2 （DR2）： 1.0 mL DR2 試劑瓶（儲(chǔ)存在 4°C)

MG132： 25 μL 小瓶（DMSO 中為 10 mM;儲(chǔ)存在 -20°C)

PR-619： 25 μL 小瓶（DMSO 中為 22 mM;儲(chǔ)存在 -20°C)

1，10-菲咯啉： 100 μL 小瓶（DMSO 中為 500 mM;儲(chǔ)存在 -20°C)

協(xié)議：

1.從冰箱中取出盤(pán)子，從冰箱中取下試劑，使其達(dá)到室溫（RT）。所有孵育均在室溫（22°-27°C）下進(jìn)行。為避免交叉污染，請(qǐng)勿重復(fù)使用銘牌密封劑。

2.制備細(xì)胞裂解物，并使用用PBS稀釋的15-20?g/孔（Vt=50-100?l/孔）。

3.在室溫下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)板2小時(shí)。

4.帶PBST的洗滌板（4 x 180mL/井）。最后一次洗滌后，輕輕去除最后一滴緩沖液在紙巾或其他吸墨紙上輕拍盤(pán)子（倒置）。不允許井完全干燥。

5.在1x封閉劑中稀釋一次抗體（稀釋取決于一次抗體的效率；良好開(kāi)始稀釋為1?g/mL），加入50-100?L/孔，并在室溫下振蕩培養(yǎng)板1小時(shí)。

6. 按照上述步驟重復(fù)洗滌（參見(jiàn)步驟4）。

7. 在1x封閉劑中稀釋第二HRP綴合的抗體（根據(jù)制造商），加入50-100?L/孔，在室溫下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)板1小時(shí)。

8. 按照上述步驟重復(fù)洗滌（參見(jiàn)步驟4）。

9. 使用前，將800?L DR1和800?L DR 2混合到10 mL超純水（去離子或蒸餾）。向每個(gè)孔中添加50-100?L該溶液，并使用針對(duì)化學(xué)發(fā)光5-10次，間隔1分鐘。

注意事項(xiàng)：

1.為了監(jiān)測(cè)目標(biāo)蛋白的多泛素化及其降解，并且在PROTAC的Dmax之后。

2.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡優(yōu)化抗體稀釋度和靶蛋白的特異性。目標(biāo)的選擇抗體應(yīng)該適用于基于夾心ELISA的測(cè)定。

3.根據(jù)目標(biāo)豐度優(yōu)化裂解物濃度。

4.參見(jiàn)下面建議的裂解緩沖液，以具有目標(biāo)蛋白的最佳多泛素化譜。

5.包括最佳結(jié)果和解釋的適當(dāng)控制

細(xì)胞裂解方案：

1.完全吸取培養(yǎng)基，并用冰冷的1X PBS沖洗細(xì)胞。用1X適當(dāng)刮除單元格PBS，離心以沉淀細(xì)胞并除去PBS。

2.在-80°C下冷凍細(xì)胞沉淀以長(zhǎng)期儲(chǔ)存或在冰上進(jìn)行裂解。

3.加入RIPA裂解緩沖液（顆粒體積的5-10倍，即100mL顆粒添加500-1000?L裂解緩沖器）。間歇性渦旋10-15分鐘，同時(shí)將樣品保持在冰上以進(jìn)行有效的裂解。

4.在4°C下以13000 xg離心15-20分鐘。

5.收集上清液（裂解物）并使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

PROTAC檢測(cè)板試劑盒測(cè)定實(shí)例：

圖1：（A） Jurkat細(xì)胞未經(jīng)處理（DMSO）或用dBET1 PROTAC（0.01-12.0μM）處理45分鐘。按照PROTAC測(cè)定板。結(jié)果表示為平均化學(xué)發(fā)光度的倍數(shù)變化±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）。

（B） 對(duì)如（A）中處理的Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞裂解物（25μg）進(jìn)行BRD3和β-肌動(dòng)蛋白的免疫印跡。蛋白酶體抑制劑MG132用作對(duì)照以防止BRD3降解。

圖2：（A） 用dBET1 PROTAC（1μM）處理Jurkat細(xì)胞不同時(shí)間（0-120分鐘）。細(xì)胞裂解物（15μg/孔）按照PROTAC測(cè)定板手冊(cè)中所述進(jìn)行處理。結(jié)果表示為平均化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的倍數(shù)變化±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）。

（B） 對(duì)如（A）中處理的Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞裂解物（25μg）進(jìn)行BRD3和β-肌動(dòng)蛋白的免疫印跡。蛋白酶體抑制劑MG132用作對(duì)照以防止BRD3降解。

圖3：（A-B）用PROTAC（1μM）處理K562細(xì)胞不同時(shí)間。細(xì)胞裂解物（15μg/孔）按照手冊(cè)中所述進(jìn)行處理PROTAC測(cè)定板（目錄號(hào)PA950）。結(jié)果表示為平均化學(xué)發(fā)光度的倍數(shù)變化±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）。

（C） 對(duì)來(lái)自如（A）中處理的K562細(xì)胞的細(xì)胞裂解物（25μg）進(jìn)行BTK和AURKA的免疫印跡。使用MG132作為對(duì)照（最后一條車道）。