NADP和NADPH在代謝和氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NADP作為多種酶促反應(yīng)的輔酶，尤其在光合作用和抗氧化應(yīng)激防御中起重要作用。NADPH是NADP的還原形式，對(duì)生物合成反應(yīng)（如脂肪酸和核苷酸合成）至關(guān)重要。此外，NADPH作為一種強(qiáng)還原劑，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷并維持氧化還原平衡。NADP和NADPH之間的動(dòng)態(tài)相互作用對(duì)細(xì)胞功能和整體代謝平衡不可或缺。AkrivisBio的NADP/NADPH檢測(cè)試劑盒是一種簡(jiǎn)單、靈敏的比色法檢測(cè)方法，能夠在多種生物樣本中低至100皮摩爾水平定量檢測(cè)NADP和/或NADPH。

艾美捷輔酶Ⅱ(NADP)-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)測(cè)定試劑盒：

貨號(hào)：MA-0126

規(guī)格：100孔

樣本類型：細(xì)胞裂解液、組織裂解液

適用物種：所有

檢測(cè)方法：比色法，吸光度450納米

檢測(cè)類型：定量檢測(cè)

應(yīng)用：一種基于微孔板的比色法檢測(cè)方法，用于在多種生物樣本中測(cè)量NADP和/或NADPH水平。

靈敏度：100皮摩爾

儲(chǔ)存條件：-20°C

運(yùn)輸溫度：冰凝膠包運(yùn)輸

保質(zhì)期：自發(fā)貨之日起一年

輔酶Ⅱ(NADP)-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)測(cè)定試劑盒檢測(cè)原理：

1.樣本中存在的NADP被特異性的NADP依賴型乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為NADPH。

2.NADPH用于還原一種近乎無(wú)色的四氮唑鹽，生成高度有色的甲臜。在此過(guò)程中，NADPH被重新轉(zhuǎn)化為NADP。

3.通過(guò)在選定緩沖液中適當(dāng)pH下孵育，可以選擇性地破壞樣本中的NADP，而不影響NADPH。

輔酶Ⅱ(NADP)-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)測(cè)定試劑盒內(nèi)容：

-提取緩沖液：50毫升（MA-0126A）

-循環(huán)緩沖液：15毫升（MA-0126B）

-乙醇脫氫酶：0.2毫升（綠色，MA-0126C）

-WST試劑：凍干粉（紫色，MA-0126D）

-終止液：1.2毫升（紅色，MA-0126E）

-NADPH標(biāo)準(zhǔn)品：凍干粉（黃色，MA-0126F）

用戶自備材料：

-PBS

-DMSO

-10kDa分子量截止離心過(guò)濾器

儲(chǔ)存和處理：

-未開封的試劑盒應(yīng)儲(chǔ)存于-20°C。

-打開前將所有小瓶短暫離心數(shù)秒。

-使用前將試劑盒組分恢復(fù)至室溫。

-提取緩沖液和循環(huán)緩沖液：即用型，儲(chǔ)存于4°C。

-乙醇脫氫酶：使用時(shí)置于冰上。如果試劑盒將在幾周內(nèi)多次使用，可分裝成小份量并儲(chǔ)存于-20°C。

-WST試劑：用1.2毫升去離子水溶解。靜置2分鐘后輕輕振蕩以溶解。儲(chǔ)存于4°C。

-終止液：即用型，儲(chǔ)存于4°C。

-NADPH標(biāo)準(zhǔn)品：用200微升DMSO溶解。儲(chǔ)存于4°C。

檢測(cè)步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：將NADPH標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.4微摩爾/升（將10微升標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移至含有990微升提取緩沖液的試管中，得到4皮摩爾/微升NADPH）。將稀釋后的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品0、5、10、15、20、25微升分別轉(zhuǎn)移至96孔板的一系列孔中，雙份進(jìn)行，分別得到0、20、40、60、80和100皮摩爾/孔。用提取緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。

注意：稀釋后的NADPH溶液不穩(wěn)定，必須在幾小時(shí)內(nèi)使用。細(xì)胞或組織裂解后的NADPH易因多種酶的存在而降解。通過(guò)以下方法可以更好地保存NADP/NADPH：將裂解樣本通過(guò)10kDa分子量截止濾器過(guò)濾，或使用我們的樣品脫蛋白試劑盒沉淀蛋白（確保最終溶液呈中性或堿性）。

2.樣本準(zhǔn)備：

-細(xì)胞：用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞（4×10?個(gè)）或組織（50毫克）。以2000×g離心5分鐘收集洗滌后的細(xì)胞。移除上清液，加入800微升提取緩沖液，混合后置于冰上10分鐘。以16,000×g離心，將上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中。

-組織：用500微升提取緩沖液勻漿化，置于冰上10分鐘。以16,000×g離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中。

-總NADP+NADPH檢測(cè)：將50微升提取后的樣本轉(zhuǎn)移至96孔板的孔中，雙份進(jìn)行。

-僅檢測(cè)NADPH：將200微升每個(gè)樣本轉(zhuǎn)移至微量離心管中，在60°C下加熱30分鐘以分解NADP。在此條件下，NADP被選擇性分解。冷卻至冰上。如有沉淀，短暫離心樣本。將50微升每個(gè)樣本轉(zhuǎn)移至96孔板的孔中，雙份進(jìn)行。

3.啟動(dòng)反應(yīng)：每個(gè)孔需要100微升反應(yīng)混合液。根據(jù)要檢測(cè)的孔數(shù)準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)混合液。

-循環(huán)緩沖液：98微升

-乙醇脫氫酶：2微升

混合均勻后，將100微升混合液加入每個(gè)孔中。讓孔板靜置5分鐘，以將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH，然后再啟動(dòng)循環(huán)反應(yīng)。

4.向每個(gè)孔中加入10微升WST試劑并混合。

5.測(cè)量：在室溫下，以動(dòng)力學(xué)模式在450納米處監(jiān)測(cè)反應(yīng)，最長(zhǎng)可達(dá)4小時(shí)。

注意：這是一個(gè)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，反應(yīng)速率與NADPH的量成正比。如果需要，可以通過(guò)向每個(gè)孔中加入10微升終止液來(lái)停止反應(yīng)。反應(yīng)停止后，顏色在密封孔板中可穩(wěn)定保持24-48小時(shí)。

6.典型結(jié)果：

7.計(jì)算：使用固定時(shí)間點(diǎn)的值或通過(guò)確定各個(gè)反應(yīng)的斜率，從所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中減去0標(biāo)準(zhǔn)品的值。仔細(xì)檢查動(dòng)力學(xué)曲線，并選擇僅包含吸光度隨時(shí)間線性增加的時(shí)間范圍。隨著吸光度的增加，反應(yīng)速率趨于下降，導(dǎo)致反應(yīng)進(jìn)程呈現(xiàn)向下曲線。將標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制為吸光度或斜率與NADPH皮摩爾的關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線的上端出現(xiàn)凸起，顯示出輕微的非線性，不在直線上的點(diǎn)應(yīng)被排除。將標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)用于每個(gè)樣本，即將樣本值除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。