乙酰輔酶A是細(xì)胞代謝和能量產(chǎn)生中的關(guān)鍵分子。作為細(xì)胞內(nèi)不同代謝途徑的中心樞紐，乙酰輔酶A在三羧酸循環(huán)中發(fā)揮核心作用，產(chǎn)生富含能量的分子（如ATP），并且是脂肪酸、膽固醇及其他重要細(xì)胞組分合成的前體。其多功能性和重要性使乙酰輔酶A成為維持細(xì)胞過程和整體代謝穩(wěn)態(tài)的基本分子。多種酶缺陷對(duì)乙酰輔酶A代謝有不利影響，其中包括丙酮酸脫氫酶缺乏癥、楓糖尿癥、酮硫解酶缺乏癥、HMG-CoA裂解酶缺乏癥和多種酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥。AkrivisBio的乙酰輔酶A檢測(cè)試劑盒是一種簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)方法，可用于測(cè)量多種樣本中的乙酰輔酶A含量，檢測(cè)范圍為0-400皮摩爾。

艾美捷乙酰輔酶A測(cè)定試劑盒：

貨號(hào)：MA-0127

樣本類型：細(xì)胞裂解液、組織提取液

適用物種：通用（適用于所有物種）

檢測(cè)方法：熒光法，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)=535/587納米

檢測(cè)類型：定量

應(yīng)用：基于微孔板的熒光法檢測(cè)，用于定量生物樣本中的乙酰輔酶A水平。

靈敏度：0-400皮摩爾

儲(chǔ)存條件：-20°C

運(yùn)輸條件：凝膠冷藏包

乙酰輔酶A測(cè)定試劑盒檢測(cè)組分：

-檢測(cè)緩沖液：25毫升，貨號(hào)WMMA-0127-A

-二氫熒光素二鈉：0.2毫升，藍(lán)色，貨號(hào)MA-0127-B

-磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶：0.1毫升，綠色，貨號(hào)MA-0127-C

-α-酮戊二酸脫氫酶/二氫熒光素二鈉：0.5毫升，紫色，貨號(hào)MA-0127-D

-α-酮戊二酸：凍干粉，紅色，貨號(hào)MA-0127-E

-滅活劑：1.0毫升，橙色，貨號(hào)MA-0127-F

-滅活中和劑：凍干粉，透明，貨號(hào)MA-0127-G

-乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)品：凍干粉，黃色，貨號(hào)MA-0127-H

乙酰輔酶A測(cè)定試劑盒檢測(cè)原理：

1.樣本中的乙酰輔酶A被水解為輔酶A和乙酸。

2.在NAD和α-酮戊二酸存在的情況下，α-酮戊二酸脫氫酶將輔酶A轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A，過程中生成NADH。

3.NADH被二氫熒光素二鈉還原為具有強(qiáng)烈熒光的熒光素。

儲(chǔ)存和處理：

將試劑盒儲(chǔ)存于-20°C。打開試劑瓶前請(qǐng)短暫離心。

-檢測(cè)緩沖液：使用前將檢測(cè)緩沖液恢復(fù)至室溫。儲(chǔ)存于4°C。

-二氫熒光素二鈉；滅活劑：直接使用，室溫下解凍。儲(chǔ)存于4°C。

-α-酮戊二酸：用220微升檢測(cè)緩沖液溶解。儲(chǔ)存于-20°C。

-滅活中和劑：用220微升去離子水溶解。使用時(shí)保持在冰上。儲(chǔ)存于-20°C。

-乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)品：用100微升去離子水溶解，配制成10mM的溶液。使用時(shí)保持在冰上。儲(chǔ)存于-20°C。

檢測(cè)步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：

-0-500皮摩爾范圍：將乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍，將10微升轉(zhuǎn)移至990微升去離子水中。進(jìn)一步稀釋，將20微升轉(zhuǎn)移至180微升水中。最終工作溶液濃度為10微摩爾。將0、10、20、30、40、50微升分別轉(zhuǎn)移至96孔板的多個(gè)孔中，用去離子水將所有孔的體積調(diào)整至50微升，得到每孔0、100、200、300、400、500皮摩爾的乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)系列。

-0-100皮摩爾范圍：將乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍，將10微升轉(zhuǎn)移至990微升去離子水中。進(jìn)一步稀釋，將10微升轉(zhuǎn)移至490微升去離子水中。混合均勻。將0、10、20、30、40、50微升分別轉(zhuǎn)移至96孔板的多個(gè)孔中，用去離子水將所有孔的體積調(diào)整至50微升，得到每孔0、20、40、60、80、100皮摩爾的乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)系列。

2.樣本準(zhǔn)備：

-樣本中的酶會(huì)迅速降解乙酰輔酶A，干擾檢測(cè)。使用PI-0102、PI-0103或等效方法對(duì)樣本進(jìn)行去蛋白處理。組織樣本（20-1000毫克）應(yīng)迅速冷凍（液氮或甲醇/干冰），稱重并研磨。加入2微升1N高氯酸/毫克樣本。保持低溫，通過勻漿或超聲處理破壞樣本。以16,000×g離心。用3M碳酸氫鉀中和上清液，加入1微升/10微升上清液的1微升等分量，同時(shí)渦旋，直到氣泡生成停止（2-5個(gè)等分量）。置于冰上5分鐘。檢查pH（使用1微升）應(yīng)約為pH6-8。以16,000×g離心2分鐘沉淀高氯酸鉀。將10微升樣本轉(zhuǎn)移至96孔板的成對(duì)孔中；用檢測(cè)緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。

-樣本中的游離輔酶A、丙二酰輔酶A和琥珀酰輔酶A會(huì)產(chǎn)生背景信號(hào)。為了校正背景信號(hào)，向所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和背景對(duì)照中加入10微升滅活劑以猝滅游離輔酶A。室溫下孵育5分鐘，然后加入2微升滅活中和劑，混合并孵育5分鐘。此外，為每個(gè)樣本運(yùn)行一個(gè)背景對(duì)照，通過省略轉(zhuǎn)化酶來校正琥珀酰輔酶A或其他輔酶A酯。

3.啟動(dòng)反應(yīng)：每個(gè)反應(yīng)需要50微升反應(yīng)混合液。

4.測(cè)量：使用激發(fā)波長(zhǎng)535納米、發(fā)射波長(zhǎng)587納米的熒光讀取器監(jiān)測(cè)熒光。存在一種非常緩慢的線性自催化反應(yīng)，其發(fā)生與乙酰輔酶A的量成正比。為了校正這一點(diǎn)，確定反應(yīng)開始后10-15分鐘的漂移率，并將該速率外推回0時(shí)間（反應(yīng)混合液加入時(shí)間）。

5.典型結(jié)果：

6.計(jì)算：

-從所有讀數(shù)中減去0標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)。背景信號(hào)可能較大，必須從樣本讀數(shù)中減去。確定每個(gè)樣本的背景值，并從原始乙酰輔酶A讀數(shù)中減去，以獲得校正后的乙酰輔酶A熒光。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。將標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)用于校正后的樣本讀數(shù)，以獲得樣本孔中的乙酰輔酶A皮摩爾數(shù)。確定原始樣本中的乙酰輔酶A：

-A.孔中的乙酰輔酶A皮摩爾數(shù)/加入孔中的樣本微升數(shù)=樣本中的乙酰輔酶A皮摩爾/微升

-B.樣本中的乙酰輔酶A皮摩爾/微升×樣本總體積=樣本中的總乙酰輔酶A

-C.樣本中的總乙酰輔酶A/毫克組織（或細(xì)胞數(shù)量等）=每毫克組織（或細(xì)胞數(shù)量等）中的乙酰輔酶A皮摩爾