Nephrat II是一種酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），用于定量測量生物樣本中的大鼠白蛋白濃度。

預(yù)期用途 ：

Nephrat II專為尿液樣本設(shè)計，但也可輕松適應(yīng)其他生物樣本。該檢測用于研究應(yīng)用，不適用于診斷用途。

技術(shù)背景

Nephrat II是一種直接抗體捕獲競爭性檢測。Nephrat II檢測板涂有大鼠白蛋白（r白蛋白），這是固定相或吸附相抗原。將含有r白蛋白的樣本加入板中，這些樣本提供移動相中的抗原。隨后，將抗r白蛋白抗體-HRP偶聯(lián)物加入板中。  

偶聯(lián)物中的抗體部分會與固定相中的大鼠白蛋白或移動相中的白蛋白結(jié)合，因此稱為競爭性結(jié)合。移動相中未反應(yīng)的試劑和免疫復(fù)合物隨后被洗去，只有與吸附相抗原結(jié)合的偶聯(lián)物會保留下來。  

使用TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）作為HRP的顯色底物來測定結(jié)合的偶聯(lián)物。將其加入板中，顏色會在5-20分鐘內(nèi)顯現(xiàn)。通過加入稀酸終止反應(yīng)。  

通過運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液與樣本一起進(jìn)行檢測，以標(biāo)準(zhǔn)化檢測。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測量含有稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的孔的吸光度。  

顏色強(qiáng)度與移動相中r白蛋白濃度的對數(shù)成反比。因此，含有高濃度r白蛋白的（移動相）樣本會產(chǎn)生淺色孔，而幾乎不含或不含r白蛋白的樣本則會呈現(xiàn)深色。通過模擬標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-反應(yīng)曲線，并根據(jù)測量的吸光度計算未知樣本濃度，從而獲得定量結(jié)果。

樣本采集與儲存

采集樣本時不要添加防腐劑，并在必要時通過離心澄清。澄清后的尿液可在4?C下保存長達(dá)1周，或在-60?C下保存長達(dá)2個月。在檢測前，讓樣本恢復(fù)至室溫。解凍冷凍樣本時不要加熱。

艾美捷Ethos Biosciences-Nephrat II(大鼠白蛋白ELISA)【#NR002】組成 ：

1. 2塊96孔Nephrat II檢測板  

2. 1瓶1.8 mL大鼠血清白蛋白（RSA）標(biāo)準(zhǔn)品  

3. 2瓶12 mL NHEBSA（稀釋液）  

4. 2瓶12 mL抗RSA抗體-HRP  

5. 2瓶12 mL TMB顯色劑  

6. 2瓶12 mL酸性終止液  

NHEBSA、RSA標(biāo)準(zhǔn)品和HRP偶聯(lián)物均含有防腐劑（異噻唑啉酮）。TMB顯色劑含有甲醇、二甲基亞砜、丙酮、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫。終止液含有稀硫酸。這些試劑可能存在接觸危害，應(yīng)遵循常規(guī)實(shí)驗(yàn)室安全程序。試劑盒各組分即開即用，但在開始檢測前應(yīng)恢復(fù)至室溫。只需在開始前將試劑盒組分放置在實(shí)驗(yàn)臺上1小時即可。檢測板為干板，但無需預(yù)處理即可用于檢測。將對照品、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和HRP偶聯(lián)物直接加入板中。

檢測步驟

檢測需要將對照品、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本加入板中。檢測體積為100 ?L。這些添加應(yīng)使用適當(dāng)?shù)囊埔浩魍瓿桑纯烧{(diào)節(jié)至100 ?L的移液器。對于樣本稀釋，將10 ?L樣本加入90 ?L稀釋液中，這需要可設(shè)置為這些體積的移液器。HRP偶聯(lián)物按每孔100 ?L加入。最好使用多通道移液器完成此操作。  

加入HRP偶聯(lián)物后，將板孵育30分鐘。為確保板處于穩(wěn)定的環(huán)境中，應(yīng)在密閉容器中進(jìn)行孵育，該容器處于濕潤的環(huán)境中。使用一個塑料容器（如Tupperware），在容器底部放置一條濕潤的紙巾，已被證明是一個滿意的孵育箱。  

30分鐘后，通過洗滌板去除溶液相中未反應(yīng)的試劑和r白蛋白-抗r白蛋白PAb-HRP偶聯(lián)物復(fù)合物。對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，冷水自來水可作為洗滌緩沖液。如果洗滌池有限，可使用洗滌緩沖液洗滌檢測板。推薦使用Ethos的TEA洗滌緩沖液。  

檢測的最后一步是使用HRP底物TMB。將其按每孔100 ?L加入。經(jīng)過適當(dāng)?shù)娘@色時間后，使用稀硫酸終止反應(yīng)。這兩個步驟都應(yīng)使用多通道移液器完成。

艾美捷科技是Ethos Biosciences的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。