當細胞生物學家第一次發(fā)現(xiàn)可能有一種脂質參與他們最喜歡的途徑時，這有點像在馬路對面找到一堵墻(就像當脂質學家在他們的路上找到一種蛋白質一樣……)。

由于脂質的不同性質，大多數細胞生物學家都害怕在他們的研究過程中不得不面對這種情況。好消息是，有一些簡單的方法可以幫助克服這一障礙，使研究特定途徑中的脂質變得更容易。在這里，我想介紹一些脂配體相互作用研究的分析和準備工具。

1. 覆蓋試驗Overlay assays-鑒定與給定蛋白質相互作用的脂質：

這些分析方法允許鑒定一種或多種脂質與給定蛋白質相互作用。

與Western-blot原理類似，它們的原理是在表面涂上各種類型的脂質，這些脂質將與已知的蛋白質接觸，這種蛋白質將被標記或抗體臨時檢測到。脂質的載體通常是硝化纖維素膜(圖1)。與點印跡法一樣，需要優(yōu)化一些實驗參數(如緩沖液、蛋白質純化或蛋白質濃度)。

當可用蛋白質的數量有限時，小的“覆蓋分析格式”可以用少于0.5 mg的蛋白質進行檢測。這是一種簡單的方法來測試一種感興趣的蛋白質對各種脂質的結合能力!

為了檢查蛋白質對各種類型的脂質的相對親和力，硝基纖維素陣列被標記為每種脂質的梯度。幾個相同的陣列可以證明在測試單特異性或多特異性蛋白質有用。該技術顯示出高特異性(圖2)，結果甚至比ELISA試劑盒更干凈，再次強調了實驗條件優(yōu)化的必要性。

對于那些對膜不熟悉的人，或者正在研究大量蛋白質的人，也可以使用聚苯乙烯板，用各種類型的脂質共價涂覆(稱為COVA板)。用于高含量篩選的微陣列板格式允許您在單個板上測試具有不同脂質的幾種蛋白質(親和性)。平板的每孔都有9種不同的脂質，用于檢測先前標記或通過免疫檢測的蛋白質。圖3所示的是一個蛋白質結構域(已知與兩種不同的脂質相互作用)。對于前面介紹的設置，需要優(yōu)化蛋白質濃度。

2. 下拉試驗Pull-down assays-發(fā)現(xiàn)一種已知脂質的蛋白質伙伴：

對于相反的實驗設置，當您想要識別已知脂質的蛋白質伴侶時，瓊脂糖為基礎的下拉試驗等制備技術將是您的最佳選擇:

*瓊脂糖珠包被確定的脂質可以被進一步孵育與細胞裂解液，上清液，重組蛋白…

* 然后相互作用的復合體通過離心將它們拉下來。

它允許分離脂質結合蛋白的數量適合進一步鑒定和表征。它經常與細胞裂解液一起用于“撈出”脂質對偶物(圖4)。

3.漂浮試驗Floatation assays-用于更高特異性的蛋白質-脂質相互作用

當你在尋找更高特異性的蛋白質-脂質相互作用時，另一種基于脂質富集脂質體(用作脂質/配體相互作用的基質支持)的制備方法是可用的。

與GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超離心)類似，脂質體預結合到脂質配體上，將沿著超離心制備的葡萄糖梯度分成幾個部分分布(圖5)。

艾美捷科技為您推薦脂質專家Echelon Biosciences的幾款覆蓋試驗Overlay assay的脂質互作工具：

①. PIP Strips – 研究磷脂酰肌醇(PI)與哪些蛋白互作：

PIP StripsTM是一種2 x 6 cm的疏水膜，包含8種磷脂和7種其他重要的生物脂類，每個斑點有100 pmol的脂類。通過一個簡單的蛋白質-脂質覆蓋實驗來確定脂質-蛋白質之間的相互作用。這為研究人員提供了一種方便的方法來確定他們感興趣的蛋白質是否與一種或多個結合的脂質相互作用。

PIP Strips試紙條脂類與斑點分布：

②. PIP Array

 – 研究脂質&蛋白互作靈敏度:

通過前期PIP Strips篩選，我們可以確定目標蛋白與8種磷酸肌醇及其它7種重要磷脂是否存現(xiàn)結合。如果目標蛋白與8種磷酸肌醇存在結合，如何進一步檢測其結合強度或者結合靈敏度呢?

PIP Array – Lipid-Protein Interaction Assay

PIP Array是一種4 x 5 cm的疏水膜，包含8種磷酸肌醇，提供7種含量的標準品：100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 pmol。通過一個簡單的蛋白質-脂質覆蓋實驗來確定脂質-蛋白質之間的相互作用強度和靈敏度。

PIP Array，PIP脂質蛋白結合芯片斑點分布：

③．Membrane Lipid Strips – 研究脂質和哪些膜蛋白互作

Membrane Lipid Strips是一種2 * 6 cm的疏水膜試紙條，包含了細胞膜中常見的15種具有不同生物功能的重要脂質，每種脂類含量均為100 pmol。通過一個簡單的蛋白質-脂質覆蓋實驗（PLO）來確定脂質-蛋白質之間的相互作用。這為研究人員提供了一種方便的方法來確定他們感興趣的蛋白質是否與一種或多個結合的脂質相互作用。

脂膜試紙條Membrane Lipid Strips，斑點分布：