小腸癌是一種惡性罕見癌癥，其發(fā)病率約為0.6%，死亡率約為0.3% 。十二指腸癌是小腸癌中常見的類型（30% - 50%不等），主要包括腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、間質(zhì)瘤、淋巴瘤等四種類型。近年來影像學(xué)發(fā)展迅速，總結(jié)出十二指腸病變的典型亞型，包括2個主要亞型（腺癌（D亞型）和Brunner’s腺（G亞型），其他亞型包括異位胰腺（P亞型）、肌間腺（N亞型）、淋巴管瘤（L亞型），囊性營養(yǎng)不良（C亞型），分化良好的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NET亞型）。然而，這些復(fù)雜亞型的具體特征和風(fēng)險因素的關(guān)聯(lián)尚未被揭示。近期，復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院丁琛課題組聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院侯英勇團隊以及上海交通大學(xué)趙健元團隊在Nature communications在線發(fā)表了題為"Comprehensive Proteogenomic Characterization of Early Duodenal Cancer Reveals the Carcinogenesis Tracks of Different Subtypes"的文章，本研究首次揭示了早期十二指腸癌的蛋白基因組學(xué)圖譜，通過時間解析模式探究十二指腸癌變過程中的關(guān)鍵事件，為探索十二指腸癌的亞型和分期的起源和蛋白基因組特征提供了新的認識。

艾美捷科技作為BPS Bioscience中國區(qū)代理，非常榮幸能夠作為供應(yīng)商為該項研究提供高品質(zhì)PARP1活性分析試劑盒（80580），為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的科研探索貢獻一份力量。

引用產(chǎn)品：

該項研究中使用了艾美捷科技代理的BPS Bioscience的PARP1 Colorimetric Assay Kit，用于檢測PARP1體外活性。

【實驗技術(shù)，延伸解讀】

① PARP1體外活性測定（PARP1 activity assay in vitro）

PARP1自體PARylation體外測定改編自一種已報道的方法121。簡而言之，實驗在40μl反應(yīng)液中進行，含有50mM HEPES（pH=8.0）、4mM DTT、20mM MgCl2、25μl NAD+、200nM DNA和2μg PARP1蛋白。反應(yīng)在30°C下進行30分鐘。然后，收集反應(yīng)液進行WB以檢測聚（ADP-核糖）聚合酶水平。用于測量細胞提取物和體外反應(yīng)中的PARP1活性的PARP1比色法試劑盒（BPS Bioscience, 美國, Cat# 80580）根據(jù)制造商的說明書使用。為了評估AARS1與PARP1相互作用減少PARP1活性，將純化的AARS1加入反應(yīng)液，并在試劑盒的樣品制備步驟中與PARP1共同孵育30分鐘在4°C下。

② 彗星實驗（Comet assay）

彗星試驗，推薦使用Comet試劑盒（Biogradetech，目錄：D-AKE3040）檢測培養(yǎng)細胞和組織中的單鏈和雙鏈DNA斷裂。在試驗中，正常細胞中的熒光主要局限于細胞核，因為完整的DNA無法遷移。在DNA損傷的細胞中，DNA會被堿性或中性溶液變性以檢測單/雙鏈斷裂，負電荷的DNA片段會從細胞核釋放并向陽極遷移。

【產(chǎn)品解讀】

PARP1 Colorimetric Assay Kit / PARP1活性分析試劑盒（80580）

PARP1比色法檢測試劑盒旨在測量PARP1活性，用于篩選和分析應(yīng)用。PARP1已知能催化NAD依賴性將多聚(ADP核糖)添加到組蛋白上。PARP1比色法檢測試劑盒的關(guān)鍵在于生物素化的NAD+。使用該試劑盒，PARP1反應(yīng)僅需要三個簡單步驟。首先，組蛋白蛋白質(zhì)被涂在96孔板上。接下來，生物素化的NAD+混合物（稱為PARP底物混合物）與PARP1酶和活化的DNA模板在優(yōu)化的檢測緩沖液中孵育。最后，板子經(jīng)streptavidin-HRP處理，隨后加入比色的HRP底物產(chǎn)生顏色，可以使用UV/Vis分光光度計微孔板讀數(shù)器測量。

產(chǎn)品組分：

實驗步驟（簡易漢化，請務(wù)必以英文原版說明書為準）：

步驟1：用96孔透明板包被組蛋白溶液

1.將5倍濃度的組蛋白混合物與PBS按1:5稀釋，制備1倍濃度的組蛋白混合物。

2.向每個孔中加入50 μl組蛋白混合物，并在4°C下孵育過夜。

3.使用每孔200 μl PBST緩沖液（1倍PBS含0.05% Tween 20）洗滌板子三次。

4.輕拍板子以去除液體，使其瀝干。

5.向每個孔中加入200 μl阻斷緩沖液3，室溫孵育至少90分鐘。

6.使用每孔200 μl PBST緩沖液洗滌板子三次。

7.輕拍板子以去除液體。

步驟2：核糖基化反應(yīng)

8.準備新鮮的10 mM DTT水溶液。

9.將激活的DNA按1:32稀釋與PBS。

10.準備Master Mix（每孔25 ul）：N孔 x（2.5 μl 10倍PARP緩沖液 + 2.5 μl PARP底物混合物1 + 5 μl稀釋的激活的DNA + 12.5 μl水 + 2.5 μl 10 mM新鮮的DTT）。

注意：Master Mix中DTT的濃度為1 mM。

11.向每個孔中加入25 μl Master Mix。

12.準備含DTT的1倍PARP緩沖液。通過添加1體積的10倍PARP測定緩沖液 + 1體積的10 mM DTT + 8體積的水將10倍PARP測定緩沖液稀釋為含DTT的1倍PARP測定緩沖液。

注意：1倍PARP測定緩沖液中DTT的濃度為1 mM。

13.向標(biāo)記為“Test Inhibitor”的每個孔中加入5 μl測試抑制劑。對于“Positive Control”和“Blank”，加入5 μl與稀釋抑制劑相同的稀釋劑溶液，但不加入抑制劑（稀釋劑溶液）。

14.在冰上解凍PARP1酶。簡短離心含有酶的管子，使其完全恢復(fù)管子中的全部內(nèi)容。根據(jù)實驗需要計算所需PARP1的量，并將酶稀釋至0.33 ng/μl，使用含DTT的1倍PARP緩沖液稀釋。PARP1的最終濃度將為1 nM。將剩余的未稀釋PARP1酶分裝并儲存在-80°C。不要多次使用這些分裝液。

注意：PARP1酶對凍結(jié)/解凍很敏感。避免多次凍結(jié)/解凍。不要再次使用稀釋的酶。

15.向標(biāo)記為“Positive Control”和“Test Inhibitor”的孔中加入20 μl稀釋的PARP1酶，以啟動反應(yīng)。對于標(biāo)記為“Blank”的孔，加入20 μl含DTT的1倍PARP緩沖液。室溫孵育1小時。

16.使用200 μl PBST緩沖液洗滌板子三次，然后按上述方法輕拍板子。

步驟3：檢測

17.在阻斷緩沖液3中將Streptavidin-HRP按1:50稀釋。

18.向每個孔中加入50 μl稀釋的Streptavidin-HRP，室溫孵育30分鐘。

19.使用200 μl PBST緩沖液洗滌三次，然后按上述方法輕拍板子。

20.向每個孔中加入100 μl比色HRP底物，室溫孵育，直到陽性對照孔出現(xiàn)藍色。對于PARP1，通常需要15~20分鐘才能完全顯色。然而，合適的孵育時間可能因用戶而異，應(yīng)通過實驗確定。

21.在藍色顯現(xiàn)后，向每個孔中加入100 μl 2 M硫酸，使用紫外/可見分光光度計微孔讀數(shù)器在450 nm處讀取吸光度。陰性對照-空白孔的吸光度應(yīng)約為0.05。或者，可以在不加入2 M硫酸的情況下在650 nm處讀取板子，但信號與背景比將降低。

結(jié)果展示：

在增加濃度的奧拉帕尼存在下PARP1活性的情況。奧拉帕尼（LC Labs，#O-9021）的效果使用PARP1比色法測定試劑盒（BPS Bioscience，#80580）按照試劑盒協(xié)議進行測量。使用Tecan UV/Vis分光光度計進行吸光度測量。

相關(guān)產(chǎn)品：

l PARP1 Chemiluminescent Assay Kit

l PARP2, GST-tag Recombinant

l PARP1, GST-tag Recombinant

l PARPtrap Combo Assay Kit for PARP1 and PARP2

#發(fā)表文章#

1. Li, Lingling et al. "Comprehensive proteogenomic characterization of early duodenal cancer reveals the carcinogenesis tracks of different subtypes". Nature communications vol. 14,1 (2023): 1751. doi:10.1038/s41467-023-37221-5

2. Syam, Yasmin M et al. "New Quinoxaline-Based Derivatives as PARP-1 Inhibitors: Design, Synthesis, Antiproliferative, and Computational Studies". Molecules (Basel, Switzerland) vol. 27,15 (2022): . doi:10.3390/molecules27154924

3. Li, Shuai et al. "Novel 4,5-dihydrospiro[benzo[c]azepine-1,1'-cyclohexan]-3(2H)-one derivatives as PARP-1 inhibitors: Design, synthesis and biological evaluation". Bioorganic chemistry vol. 111, (2021): 104840. doi:10.1016/j.bioorg.2021.104840

4. Yu, Jiang et al. "Design and synthesis of benzodiazepines as brain penetrating PARP-1 inhibitors". Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry vol. 37,1 (2022): 952-972. doi:10.1080/14756366.2022.2053524