RT-qPCR master mix：用于雙標(biāo)記探針的凍干RT實時PCR Master Mix；分子生物學(xué)。

艾美捷RT-qPCR master mix（PCR-159S）含有SCRIPT逆轉(zhuǎn)錄酶、HotStart聚合酶Ab+、dNTP、反應(yīng)緩沖液、MgCl2和穩(wěn)定劑。PCR級水

RT-qPCR master mix檢測準(zhǔn)備：

1. RNA/引物混合液的準(zhǔn)備

將以下組分加入到無核酸酶的微管中，并通過輕輕上下移液混合：

2. 變性和引物退火（可選）

請注意：特別推薦對展示高程度二級結(jié)構(gòu)的RNA靶標(biāo)、自身或相互補(bǔ)的引物以及新靶標(biāo)的初次實驗進(jìn)行樣品變性。對于許多標(biāo)準(zhǔn)的RNA和引物組合，可以省略熱處理，而不會對結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。

將混合物在70°C下孵育5分鐘，然后放置在室溫下5分鐘。

3. 分配主混合液

向每個含有凍干品的管子或板孔中分配20 ?l的RNA/引物混合液。

RT-qPCR master mix逆轉(zhuǎn)錄和熱循環(huán)：

將小瓶放置在PCR循環(huán)儀中，并啟動以下程序。

1) 建議進(jìn)行10分鐘的逆轉(zhuǎn)錄時間，以獲得100至200個堿基對(bp)之間最佳擴(kuò)增子長度。更長的擴(kuò)增子，長達(dá)500個堿基對，可能需要延長孵育時間為15分鐘。每增加100個堿基對，增加3分鐘。最優(yōu)溫度取決于RNA的結(jié)構(gòu)特征。對于具有高二級結(jié)構(gòu)的難處理模板，將溫度提高到55°C。請注意，應(yīng)針對每種特定的RNA調(diào)整最優(yōu)反應(yīng)時間和溫度。

2) 建議進(jìn)行5分鐘的初始變性時間，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

3) 退火溫度取決于所使用的引物和DNA探針的熔解溫度。

4) 延伸時間取決于擴(kuò)增子的長度。對于1000個堿基對的片段，建議時間為1分鐘。為了獲得最佳特異性和擴(kuò)增效果，可能需要對推薦的參數(shù)進(jìn)行個別優(yōu)化。請注意，應(yīng)針對每種特定的RNA/引物對調(diào)整最優(yōu)反應(yīng)時間和溫度。