JPT將重疊肽段沿著目標蛋白的氨基酸序列進行排列，以實現(xiàn)T細胞刺激的最優(yōu)化，同時盡量減少遺漏T細胞表位的可能性。您可以使用PepMix肽段混合物來替代蛋白（例如重組蛋白）或病原體裂解物，用于抗原特異性T細胞的刺激。與蛋白抗原相比，PepMix肽段混合物能夠提供更有效的刺激，因為它們不需要通過抗原呈遞的外源途徑進行處理。PepMix肽池在全球范圍內(nèi)被廣泛用于基礎和臨床研究的各種目的，例如抗原特異性T細胞的檢測、計數(shù)和功能分析，增殖研究以及T細胞擴增等。

提供的細胞內(nèi)細胞因子染色（ICS）和酶聯(lián)免疫斑點（ELISpot）實驗方案詳細說明了在外周血單個核細胞（PBMCs）懸液中刺激T細胞的方法。PBMCs可以通過密度梯度離心從抗凝（最好使用肝素抗凝）的全血中新鮮制備。這些實驗方案僅作為使用PepMix的示例，如果使用全血或包含其他來源T細胞的懸液，則需要對實驗步驟進行調(diào)整。

PepMix肽池

一般情況下，PepMix肽池包含15個氨基酸長度的肽段，覆蓋所指示蛋白的完整序列，且相鄰肽段之間有11個氨基酸的重疊。每瓶含有每種肽段25微克（約15納摩爾），足以刺激多達2.5×10?個細胞。每種肽段均為化學合成、純化，并在加入PepMix之前通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）進行分析。

酶聯(lián)免疫斑點（ELISpot）和細胞內(nèi)細胞因子染色（ICS）實驗方案

酶聯(lián)免疫斑點（ELISpot）實驗：本方案是為外周血單個核細胞（PBMCs）的刺激而設計的。如果用于其他材料，可能需要進行調(diào)整。PBMCs可以從全血或白細胞層分離得到。或者，也可以使用凍存的PBMC樣本。在這種情況下，設置一個讓細胞恢復的靜置步驟可能是有用的。

1. 向包被有捕獲抗體的ELISpot板的每個孔中加入100微升含有10萬到30萬個細胞（1-3×10?細胞/毫升）的細胞懸液。此外，向每個孔中加入100微升刺激液（最終濃度加倍）。

2. 將板置于37℃、5% CO?的濕化培養(yǎng)箱中孵育至少16小時，以刺激細胞。

3. 多次洗滌板以去除附著的細胞。

4. 向孔中加入您選擇的合適檢測抗體，使其達到期望的濃度（例如1微克/毫升）。

5. 在濕化培養(yǎng)箱（37℃，5% CO?）中孵育2小時。

6. 多次洗板。

7. 如果使用生物素標記的抗體，在此步驟加入鏈霉親和素偶聯(lián)的酶，并在室溫下于暗處孵育1小時。

8. 多次洗板。

9. 向孔中加入100微升適當?shù)牡孜铮却唿c顯色（通常在3-7分鐘后）。

10. 用自來水沖洗孔以終止反應。

11. ELISpot板在分析前應晾干。

12. 最好使用ELISpot讀板儀計數(shù)斑點。

細胞內(nèi)細胞因子染色（ICS）實驗：在標準的96孔圓底板中，適合用于PBMC刺激的總體積為200微升。例如，您可以在該體積中刺激20萬到50萬（0.2×10⁶到0.5×10⁶）個細胞。我們建議將細胞濃度調(diào)整為2×10⁶個細胞/毫升，以便在100微升細胞懸液中分裝20萬（0.2×10⁶）個細胞。

將細胞制備調(diào)整為2×10⁶個細胞/毫升，使用合適的檢測培養(yǎng)基，例如1640 RPMI培養(yǎng)基，其中含有2 mmol/L L-谷氨酰胺、5%（體積比）人AB型男性血清、1% MEM非必需氨基酸溶液（100倍濃縮）和1 mM丙酮酸鈉溶液（100 mM）。短期刺激可能不需要添加抗生素。從PepMix儲備液中在檢測培養(yǎng)基中制備雙倍濃度的PepMix溶液，并補充20 ug/ml布雷菲德菌素A（雙倍工作濃度）。

1. 向無菌96孔板的每個孔中加入100微升含有20微克/毫升布雷菲德菌素A（雙倍工作濃度）的肽溶液。對于未刺激對照組，將100微升含有相應量DMSO和布雷菲德菌素A的檢測培養(yǎng)基加入孔中。每個實驗條件以及陽性和陰性對照組至少準備兩個重復孔（兩個孔）。  

**注意**：如果同時使用另一種刺激物（例如蛋白、細菌或病毒裂解物）進行平行刺激，而這些刺激物需要細胞內(nèi)蛋白處理，從而需要延遲中斷蛋白向高爾基體的運輸以阻斷細胞因子分泌，那么可以在加入肽2小時后再向細胞中加入布雷菲德菌素A。  

2. 向每個孔中加入100微升含有20萬個細胞的細胞懸液。  

3. 蓋上板蓋，將板置于標準細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO₂飽和水汽環(huán)境）中進行細胞刺激。根據(jù)您的科學問題，細胞可以刺激6到16小時。  

4. 刺激完成后，將板以300×g、4℃離心6分鐘。小心地通過輕柔但有力地晃動板來丟棄上清液。  

5. 用含有0.5%（重量/體積）牛血清白蛋白的200微升PBS重懸細胞沉淀。  

6. 再次離心板，并按照步驟4所述丟棄上清液。  

7. 在50微升的最終體積中進行表面染色，用于免疫表型分析，4℃黑暗中孵育20分鐘。至少使用針對CD3、CD4和CD8的抗體來區(qū)分細胞毒性T淋巴細胞和T輔助細胞。這些抗體應適用于隨后的固定和通透處理程序。通過抗體滴定驗證必要的抗體濃度。  

8. 染色后，加入含有0.5%（重量/體積）牛血清白蛋白的150微升PBS，并將板以300×g、4℃離心6分鐘。小心地通過輕柔但有力地晃動板來丟棄上清液。  

9. 用含有0.5%（重量/體積）牛血清白蛋白的200微升PBS重懸細胞沉淀。  

10. 再次離心板，并按照步驟8所述丟棄上清液。  

11. 用含有甲醇和皂甙的固定緩沖液（例如每孔50微升BD Cytofix/Cytoperm）對細胞進行通透處理，用于細胞內(nèi)染色，4℃黑暗中孵育20分鐘。  

12. 每孔加入150微升維持細胞通透狀態(tài)的洗滌緩沖液（例如BD Perm/Wash緩沖液），并將板以300×g、4℃離心6分鐘。小心地通過輕柔但有力地晃動板來丟棄上清液。  

13. 用200微升洗滌緩沖液重懸細胞沉淀。  

14. 再次離心板，并按照步驟12所述丟棄上清液。  

15. 將適合您感興趣的細胞因子的細胞內(nèi)染色抗體稀釋在洗滌緩沖液中，每孔加入50微升混合液。充分混勻，但避免因緩沖液中的皂甙而產(chǎn)生泡沫。4℃黑暗中孵育30分鐘。  

16. 細胞內(nèi)染色完成后，每孔加入150微升洗滌緩沖液，并將板以300×g、4℃離心6分鐘。小心地丟棄上清液。  

17. 用流式細胞術緩沖液（例如含有0.5%（重量/體積）牛血清白蛋白的Dulbecco改良磷酸鹽緩沖液（D-PBS））重懸細胞沉淀。  

18. 再次離心板，并按照步驟16所述丟棄上清液。  

19. 用100微升流式細胞術緩沖液重懸細胞沉淀，并根據(jù)您的儀器進行流式細胞術檢測。

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