您不曾了解系列3—活細胞DNA染色

【前情回顧】前期小伙伴發表了2篇關于活細胞tubulin和F-actin染色的文章：

【1】您不曾了解系列：微管蛋白tubulin染色（活細胞），點擊了解

【2】您不曾了解系列2：活細胞微絲F-actin染色（兼容固定細胞），點擊了解

今天我們就來聊聊活細胞的DNA染色吧！

目前市面上有幾種DNA熒光探針，如溴化乙錠（EB）、DAPI、Hoechst™和遠紅色染料，如SiR-DNA™ (SiR-Hoechst*) 、Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™Ruby。目前，在活細胞的DNA染色中，有兩組染料。第一組是Hoechst系列，它們具有細胞滲透性和熒光性（即低熒光直到結合靶DNA），但由于340-360nm范圍內短紫外-藍色波長激發的要求，它們具有相當的毒性。

第二組活細胞染料由遠紅外染料組成，如SiR-DNA™、Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™Ruby。這些染料克服了前一組光譜范圍的限制，允許使用波長約為650nm、發射波長約為700nm的低能激發光。這種光具有最小的光毒性（SiR-Tubulin™和SiR-Actin™）并且細胞或組織樣品在該光譜范圍內不吸收光也不自發熒光，這使得在厚樣本中有更深處成像成為可能。

相比之下，DAPI和溴化乙錠不具有細胞滲透性，DAPI需要短的紫外波長激發，EB是藍光波長，在350 nm范圍內非常有很好的活力，這兩種染料活細胞成像超過1-10分鐘，會對活細胞造成光損傷（氧化）。此外，在這個光譜范圍內，組織和細胞具有很高的吸收率和自發熒光。因此，很難在組織樣本的深處成像。最后，由于細胞暴露在激發光下的時間有限，這些染料不適合超分辨率分析，且溴化乙錠會導致細胞發生突變。

SiR-DNA™（SiR–Hoechst）是基于熒光團硅羅丹明（SiR）和DNA小槽粘合劑雙苯甲酰亞胺（Hoechst）組合而成，它比遠紅外染料組其他染料更具優勢。Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™紅寶石染料的問題在于：它們要么在廠家建議使用的濃度下對細胞顯示出強烈的毒性作用（細胞停止分裂或死亡），而SiR-DNA可以在8小時的正常實驗時間內持續使用，而且可能更長。Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™等紅寶石染料也在活細胞的DNA以外的其他結構上產生強烈的非特異性信號。SYTO61與超分辨顯微鏡兼容，但其高背景熒光和毒性使其不具有吸引力，SiR-DNA信號在多次暴露于激發光下時仍然很強，在穩定性測試中，在140次暴露/時間點記錄后，染料保持了其原始強度的70%。

SiR–Hoechst（SiR-DNA™） 和其他遠紅外DNA染料長時間活細胞成像對比圖，顯示SiR–Hoechst的低毒性及熒光穩定性

市面上幾種常見DNA染料對比

注：SiR-DNA™是Spirochrome SA公司的商標 (瑞士)

Vybrant® DyeCycle™ Ruby stain 和Syto61™是美國Thermo Fisher Scientific公司的商標

注：SiR-DNA™是Spirochrome SA公司的商標 (瑞士)

DRAQ5™是Biostatus公司商標

Hoechst™是美國Sanofi公司商標

SiR-DNA™的主要發展方向是將熒光特性、高DNA特異性、低毒性與遠紅外激發/發射范圍相結合。此外，由于其穩定性和對遠紅光的特性，探針在超分辨顯微鏡（STDE和SIM）中表現非常好。因此，SiR-DNA™是一種優良的探針，其性能與SiR-tubulin和SiR-actin一樣優秀。

在顯微鏡觀察和高通量篩選過程中，SiR-DNA™可以在不受紫外線刺激的情況下進行簡單的核復染。在流式細胞術過程中，SiR-DNA™可以直接用于血液/BM的表型分析和細胞DNA含量分析，而無需紅細胞溶解或固定、滲透或RNase處理等步驟。

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* 活細胞DNA染色試劑盒均內含Verapamil（維拉帕米，戊脈安），一種廣譜的外排泵抑制劑。

廠家質檢：

常見問題整理：

是否兼容固定細胞？

SiR-DNA™可以與甲醇或PFA固定的細胞一起使用。然而，介質對SiR-DNA™的亮度有很大的影響。當混有PBS或Vectashield®的細胞產生很低的信號，混合有純甘油的細胞會染出非常明亮的細胞核。因此，我們建議在用SiR-DNA™染色固定細胞時使用純甘油作為介質。

哪些物種的樣本和組織能被SiR探針染色？

下方僅引述已報告起作用的細胞系、組織或生物體。

智人：U2OS，成纖維細胞，HeLa，HUVEC, MCF-10A, HCT-116, A549,紅細胞

肌肉：C2C12，IA32，骨骼肌，原代心肌細胞，原代卵母細胞

褐家鼠：初級海馬神經元、初級皮質神經元、NRK

風信子：COS-7

金鯽：BHK

黑腹果蠅：Notum上皮，S2

迪德爾菲斯有袋動物：OK細胞

為什么SiR探針的背景比其他熒光團低？

SiR探針使用的是近紅外/遠紅外光譜范圍內的激發光，從而避免較短波長的光產生自發熒光，從而避免產生較高的背景。SiR耦合探針具有兩種物理狀態：①非熒光，關閉狀態（spirolactone）和②高熒光，開啟狀態（zwitterion）。探針與其配體目標的結合有利于高熒光的開放狀態，而未結合探針則存在于封閉、非熒光狀態（下圖）。從未結合態到結合態熒光放大率增加100倍。這就產生了一種高度敏感的生物傳感器，其中大部分熒光只發生在結合態。

SiR衍生物在熒光（開放）型（左結構）和非熒光（封閉）型（右結構）之間存在平衡

Nature Communication 專屬產品文章精彩了解：

G. Lukinavicius et al.,SiR–Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy, Nat. Commun. 6:8497 doi: 10.1038/ncomms9497 (2015).

不同類型細胞DNA成像圖，4μm SiR–Hoechst

SiR-Hoechst染色HeLa細胞的共聚焦（confocal）和電鏡（STED）對比

Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學和細胞過程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發與生產。公司提供藥物篩選、信號轉導、蛋白質轉錄后修飾（PTM）、細胞骨架研究相關的系列試劑盒和產品，尤其以細胞骨架相關研究見長，既能滿足于樣品較少的科學研究，也可以用于小規模篩選研究和高通量大規模篩選研究。

目前主要的產品有340余種，其產品主要覆蓋肌動蛋白，微管蛋白，馬達蛋白，小G蛋白，細胞外基質，活細胞成像等相關領域，提供對應的蛋白質，抗體，檢測與分析試劑盒，并且產品線還在不斷的擴大中。此外，公司還提供微管蛋白，肌動蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現有產品的藥物篩選服務。