這個協(xié)議適用于甲醛（FA）固定的細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析。科學(xué)家們使用自制的FA固定液，通過在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中溶解對甲醛（PFA），或者他們使用含有不同量的甲醇以穩(wěn)定化的現(xiàn)成FA固定液。在我們的標(biāo)準(zhǔn)ICC協(xié)議中，我們使用含有少量甲醇的現(xiàn)成FA溶液。最佳的固定時間可能因細(xì)胞類型、細(xì)胞室或抗體而異。過短或過長的固定時間可能導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性差或抗原掩蔽。在我們的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議中，我們采用15分鐘4% FA固定以獲得良好的結(jié)果。然而，有些抗體需要更短/更溫和的FA固定，甚至需要甲醇或丙酮固定，因為表位容易被FA交聯(lián)掩蔽（請參閱備注部分以獲取不同的固定協(xié)議）。

重要提示：一些蛋白質(zhì)需要特殊的要求才能良好檢測。請參閱各自數(shù)據(jù)表中關(guān)于ICC的備注部分。

艾美捷Synaptic Systems--ICC染色-甲醛固定的材料和試劑：

1、PBS：磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4

2、固定緩沖液：4% FA（或4% PFA）在PBS中，pH 7.4，4%蔗糖

3、封閉緩沖液：10%正常血清，0.1% Triton X-100在PBS中（建議使用二抗宿主物種的正常血清進(jìn)行封閉）

4、孵育緩沖液：5%正常血清，0.1% Triton X-100在PBS中（可以省略Triton；建議使用二抗宿主物種的正常血清進(jìn)行封閉）

5、封片介質(zhì)

6、可選：DAPI核染色

程序：

1、用PBS簡要沖洗細(xì)胞。

2、用固定緩沖液固定細(xì)胞15-20分鐘。

3、用PBS沖洗三次，每次10分鐘。

4、用封閉緩沖液孵育30分鐘。

5、在孵育緩沖液中含有一抗（適當(dāng)稀釋，請參閱數(shù)據(jù)表）孵育2小時。

6、用PBS沖洗三次，每次10分鐘。

7、在孵育緩沖液中含有二抗孵育1小時（最佳稀釋必須通過實驗確定）。可選：在二抗溶液中加入DAPI。使用二抗時避免強(qiáng)光以最小化熒光染料的光漂白。重要提示：當(dāng)使用熒光素偶聯(lián)的一抗時，可以省略這一步。在多重染色中，確保使用對您實驗中使用的其他一抗宿主物種進(jìn)行過交叉吸附的二抗。理想情況下，所有二抗應(yīng)來自同一宿主物種。如果不是，請確保它們也已經(jīng)對其他二抗的宿主物種的IgG進(jìn)行了交叉吸附。這避免了二抗之間的交叉反應(yīng)。

8、用PBS沖洗三次，每次10分鐘。

9、封片并用顯微鏡觀察。

注：Synaptic Systems標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議在SYSY實驗室中產(chǎn)生了良好的結(jié)果，并且可以用作參考。然而，為了獲得高的特異性信號和低的非特異性背景信號，必須單獨確定合適的抗體濃度、孵育溫度和孵育時間。

艾美捷科技是Synaptic Systems的中國代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。