TopoGEN-DNA旋轉酶檢測試劑盒旨在快速、特異地檢測DNA旋轉酶。該試劑盒有助于II型拓撲異構酶（DNA Gyrase）的純化和鑒定，并含有對具有或不具有超螺旋能力的II型酶進行常規(guī)檢測所需的所有試劑。

艾美捷DNA旋轉酶檢測試劑盒：

SKU：TG1003

類別：Topo套件

標簽：DNA旋轉酶、EC DNA旋轉酶和旋轉酶測定

旋轉酶測定試劑盒內容：

足夠進行100次測定的動基體DNA [kDNA]

線性kDNA標記

經拓撲異構酶II處理的解鏈kDNA標記（topo II處理）

10X旋轉酶測定緩沖液

旋轉酶停止和裝載緩沖液

詳細說明書

DNA旋轉酶測定試劑盒應用說明：

拓撲異構酶II或DNA旋轉酶對kDNA的解鏈程度與酶的量和孵育時間成正比。為了篩選柱分離的分數以確定活性峰，最好使用短的（5分鐘）孵育時間，這樣只有最活躍的分數會完全解鏈kDNA。對于篩選柱分離的分數或其他需要進行許多反應的測定，最好設置一個包含所有試劑的主反應混合物，除了待測分數，然后將這個混合物分裝到反應管中，再添加待測分數。

高濃度的鹽會抑制拓撲異構酶；因此，待測分數對最終反應的貢獻不應超過30 mM單價鹽。如果離子濃度超過這個值，則應使用低鹽緩沖液進行補償。

最好包括一個完整的反應，缺少蛋白分數，但包含待測分數所在的緩沖液。如果蛋白分數中含有改變DNA電泳遷移率的試劑，可能需要在加載凝膠前對樣本進行苯酚/氯仿處理和/或乙醇沉淀。

凝膠解讀：

解鏈的DNA標記將是開放環(huán)狀DNA（OC，2.5 KB單體，至少有一個缺口）和一些閉環(huán)狀DNA（CC）DNA。kDNA通常包含缺口DNA單體；因此，OC和CC DNA都將被看到。相比之下，不應產生線性DNA，因為這意味著核酸酶污染。還要注意，可以使用kDNA測定旋轉酶來識別穩(wěn)定缺口或切割中間體的試劑（見上文鏈接）。

并發(fā)癥

最嚴重的問題出現在被測定的提取物中有干擾蛋白或物質時。粗細胞提取物可能含有過量的DNA結合蛋白或正電荷蛋白，它們會粘附在DNA上并抑制酶的接觸。此外，核酸酶污染物可能會降解或缺口kDNA底物，因此模糊結果。解決這個問題的一個好方法是通過硫酸銨沉淀后跟柱層析來清理粗提取物。此外，通過稀釋提取物和/或添加tRNA載體（以競爭基本蛋白），有時可以最小化這些問題。

該試劑盒可以儲存在4°C；然而，對于長期儲存（超過1個月），我們建議將其放置在-20°C。盡量避免反復冷凍和解凍kDNA，因為這會加速網絡的降解。

旋轉酶測定基于兩步過程

1. 動基體DNA（kDNA）的解鏈

2. 由此產生的解鏈單體kDNA種類的超螺旋化

DNA旋轉酶測定過程：

反應產物是使用TopoGEN開發(fā)的一種新型凝膠系統(tǒng)來解析的，該系統(tǒng)允許極其快速和明確地檢測旋轉酶活性。包括適當的緩沖液、DNA底物和DNA標記。本試劑盒不包括純化的旋轉酶；但是，包括了解鏈和線性DNA標記，以便用戶可以清晰、方便地識別提取物或分數中的產品（見上文鏈接）。kDNA測定可以檢測刺激旋轉酶切割DNA的毒物以及僅僅抑制催化活性的試劑。基于kDNA的旋轉酶測定的優(yōu)勢在于，它快速且簡單，允許從粗混合物或提取物中進行活性引導的抑制劑純化。