時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）是一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時(shí)間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)的技術(shù)，作為一種方便靈活的均相檢測(cè)技術(shù)，TR-FRET現(xiàn)今已成為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)中最為常用的檢測(cè)方法之一。

THUNDERTM TR-FRET由加拿大Bioauxilium公司研發(fā),THUNDER?產(chǎn)品均提供全面驗(yàn)證數(shù)據(jù)。其產(chǎn)品線聚焦于細(xì)胞水平的檢測(cè)，如細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞因子，磷酸化蛋白，總蛋白，GPCR相關(guān)第二信使cAMP檢測(cè)等，也涉及適合方法學(xué)開發(fā)的工具抗體。
 

THUNDER^? TR-FRET技術(shù)原理圖

一、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

利用兩種熒光基團(tuán)能量轉(zhuǎn)移，分別是能量供體Europium Chelate（Donor）和能量受體Far-red dye（Accpeptor）。當(dāng)供體和受體相互靠近（1-10nm），320/340nm光激發(fā)Europium，光子能從供體轉(zhuǎn)移到受體上（615nm），受體發(fā)出熒光（665nm）。

FRET技術(shù)原理圖

二、時(shí)間分辨熒光（TRF）

利用鑭系元素（Eu）的獨(dú)特性質(zhì)，其熒光半衰期長(zhǎng)達(dá)ms級(jí)別。延遲50~100μs開始讀值后，未結(jié)合的受體熒光和背景熒光均已淬滅，即反映樣本真實(shí)情況。
 

TRF技術(shù)原理圖

三、THUNDERTM TR-FRET技術(shù)優(yōu)勢(shì)

①操作簡(jiǎn)單、快速: 

均相檢測(cè)技術(shù)：無(wú)需洗板和包被，只需兩步加樣→檢測(cè)，1-2h快速檢測(cè)。

②反復(fù)讀板，信號(hào)穩(wěn)定:

實(shí)驗(yàn)體系可支持反復(fù)讀值，過(guò)夜、48h后讀值亦可，如：1h，2h，4h，18h...適合預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索實(shí)驗(yàn)條件。

③節(jié)省樣本：

實(shí)驗(yàn)體系為20μl，樣本僅需15μl。

④高通量，兼容性強(qiáng)：

耗材：兼容94孔，384孔和1536孔微孔板，推薦使用潛孔板以獲得最佳窗口；

儀器：現(xiàn)售酶標(biāo)儀，安裝有TR-FRET技術(shù)模塊均可檢測(cè)。

⑤嚴(yán)格驗(yàn)證和篩選：

最優(yōu)的抗體對(duì)組合：全部抗體均從5~20對(duì)配對(duì)抗體中進(jìn)行篩選后，進(jìn)行專業(yè)嚴(yán)格驗(yàn)證，以確定最終的抗體對(duì)。 

最大窗口：優(yōu)化供體、受體濃度得到最佳信噪比（S/B）。 

提供最適配的緩沖液和裂解液。

四、THUNDERTM TR-FRET細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒

THUNDER檢測(cè)細(xì)胞因子采用經(jīng)典雙抗夾心模型，抗體結(jié)合抗原后，用320/340nm光激發(fā)供體Eu，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）后，進(jìn)而激發(fā)受體產(chǎn)生665nm信號(hào)。信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞因子濃度成正比。
 

THUNDER細(xì)胞因子檢測(cè)原理圖

取15μl樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，加入空的微孔板中，再加入5μl的抗體Mix（供體抗體，受體抗體各2.5μl），孵育2h，酶標(biāo)儀讀值。

THUNDER細(xì)胞因子檢測(cè)流程

THUNDER Human IFNγ 細(xì)胞因子檢測(cè)數(shù)據(jù)展示

熱門細(xì)胞因子/生物標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒：

五、THUNDERTM TR-FRET磷酸化/總蛋白檢測(cè)試劑盒

THUNDER檢測(cè)胞內(nèi)磷酸化蛋白采用經(jīng)典雙抗夾心模型，抗體結(jié)合抗原后，用320/340nm光激發(fā)供體Eu，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）后，進(jìn)而激發(fā)受體產(chǎn)生665nm信號(hào)。信號(hào)強(qiáng)度與胞內(nèi)蛋白磷酸化水平成正比。

THUNDER磷酸化蛋白檢測(cè)原理圖

第一步：細(xì)胞處理，需5分鐘或過(guò)夜，激動(dòng)劑/抑制劑處理細(xì)胞；第二步：細(xì)胞裂解，15~60分鐘；第三步：檢測(cè)，加檢測(cè)抗體對(duì)，孵育1小時(shí)或過(guò)夜，酶標(biāo)儀檢測(cè)。

THUNDER磷酸化/總蛋白檢測(cè)原理圖

THUNDER磷酸化ERK部分檢測(cè)數(shù)據(jù)展示

六、THUNDERTM TR-FRET cAMP檢測(cè)試劑盒

THUNDER cAMP試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)，Eu通過(guò)鏈霉親和素和生物素結(jié)合cAMP，受體FR-anti-cAMP特異性識(shí)別cAMP，當(dāng)藥物作用于GPCR膜蛋白后，胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP會(huì)與FR-anti-cAMP抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)原有的信號(hào)，信號(hào)呈現(xiàn)倒S曲線，與cAMP濃度成反比。

THUNDER cAMP檢測(cè)原理圖

首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)處理（給藥處理），細(xì)胞裂解后依次加入cAMP和檢測(cè)抗體對(duì)，孵育1小時(shí)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。
 

THUNDER cAMP驗(yàn)證數(shù)據(jù)展示

THUNDER cAMP檢測(cè)試劑盒：