UbcH5c TR-FRET檢測(cè)試劑盒是一種均勻、靈敏的TR-FRET（時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移）檢測(cè)試劑盒，旨在測(cè)量UbcH5b（泛素結(jié)合酶E2 D3）泛素化活性。該試劑盒使用生物素標(biāo)記的泛素和鋱標(biāo)記的抗體識(shí)別His標(biāo)記的UbcH5c蛋白，以完成TR-FRET配對(duì)。該試劑盒包含足夠的純化的UbcH5 c、純化的UBE1、生物素泛素、抗His-Tb標(biāo)記的供體、染料標(biāo)記的受體和400個(gè)反應(yīng)的測(cè)定緩沖液。

艾美捷UBCH 5c TR-FRET檢測(cè)試劑盒：

貨號(hào): BPS-79901

檢測(cè)試劑盒格式: TR-FRET

物種: 人類

需自備材料:

能夠測(cè)量時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）的熒光微孔板閱讀器

可調(diào)節(jié)的微量移液管和無(wú)菌吸頭

軌道搖床

UniProt #UBE1: P22314; UBCH5c: P61077

儲(chǔ)存/穩(wěn)定性: 如果按照指示儲(chǔ)存材料，該檢測(cè)試劑盒從收到之日起最佳性能可維持長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月。

應(yīng)用: 篩選抑制Ubch5c活性的分子，在藥物發(fā)現(xiàn)高通量篩選（HTS）應(yīng)用中。

運(yùn)輸溫度: -80°C

禁忌: UbcH5c TR-FRET檢測(cè)試劑盒與高達(dá)1%最終DMSO濃度兼容。我們建議在U2檢測(cè)緩沖液中以不超過(guò)10% DMSO溶液準(zhǔn)備抑制劑，并每個(gè)孔使用2 μl。

避免凍融循環(huán)。

檢測(cè)協(xié)議：

所有樣品和對(duì)照應(yīng)進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

檢測(cè)應(yīng)包括“空白”、“陽(yáng)性對(duì)照”、“陰性對(duì)照”和“試驗(yàn)抑制劑”條件。

我們建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將稀釋后的蛋白質(zhì)保持在冰上。

有關(guān)蛋白質(zhì)處理的詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱蛋白質(zhì)常見問(wèn)題解答（bpsbioscience.com）。

我們推薦使用Bay11-7821作為內(nèi)部對(duì)照。如果不對(duì)控制抑制劑進(jìn)行劑量反應(yīng)曲線測(cè)試，我們建議按照下面驗(yàn)證數(shù)據(jù)中顯示的IC50值的0.1倍、1倍和10倍來(lái)運(yùn)行控制抑制劑。

在冰上解凍UBE1、UbcH5c、U2檢測(cè)緩沖液、生物素-泛素和ATP。短暫離心管以回收全部?jī)?nèi)容物。

將UBE1用U2檢測(cè)緩沖液稀釋至20 ng/?l（每個(gè)孔1.5 ?l）。

將UbcH5c用U2檢測(cè)緩沖液稀釋至4 ng/?l（每個(gè)孔1.5 ?l）。

將生物素-泛素用U2檢測(cè)緩沖液稀釋5倍（每個(gè)孔1 ?l）。

準(zhǔn)備主混合物如下（每個(gè)孔5.5 ?l）：N個(gè)孔 × （稀釋后的UBE1 1.5 ?l + 稀釋后的UbcH5c 1.5 ?l + 稀釋后的生物素-泛素1 ?l + U2檢測(cè)緩沖液1.5 ?l）。

向“陽(yáng)性對(duì)照”、“陰性對(duì)照”和“試驗(yàn)抑制劑”孔中各加入5.5 ?l主混合物。

向“空白”孔中各加入5.5 ?l U2檢測(cè)緩沖液。

準(zhǔn)備試驗(yàn)抑制劑（每個(gè)孔2 ?l）：對(duì)于滴定，準(zhǔn)備比期望最終濃度高10倍的連續(xù)稀釋。反應(yīng)的最終體積為20 ?l。

向每個(gè)指定為“試驗(yàn)抑制劑”孔中加入2微升的抑制劑稀釋液。

向“陽(yáng)性對(duì)照”、“陰性對(duì)照”和“空白”孔中各加入2微升的溶劑溶液。

將抗His標(biāo)簽的供體和染料標(biāo)記的受體各稀釋400倍，使用U2檢測(cè)緩沖液（每孔10微升）。這將制成供體/受體混合液。

向每個(gè)孔中加入10微升的供體/受體混合液。 注意：在添加底物（ATP）之前，考慮在室溫（RT）下進(jìn)行30分鐘的預(yù)孵育步驟。

通過(guò)向“空白”、“試驗(yàn)抑制劑”和“陽(yáng)性對(duì)照”孔中各加入2.5微升4毫米ATP來(lái)啟動(dòng)反應(yīng)。

向“陰性對(duì)照”孔中加入2.5微升U2檢測(cè)緩沖液。

避免光照，并在室溫下孵育反應(yīng)30分鐘，或進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)的動(dòng)力學(xué)分析。

使用能夠測(cè)量TR-FRET的微孔板閱讀器讀取熒光強(qiáng)度。

應(yīng)從所有其他值中減去“空白”值。

UBCH 5c TR-FRET檢測(cè)試劑盒示例結(jié)果：

圖:Bay11-7821抑制了UbcH5c的活性。在Bay11-7822濃度增加的情況下測(cè)量了UbcH5的活性（Tocris#1744）。結(jié)果表示為相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照的活性百分比（在沒(méi)有抑制劑的情況下測(cè)量，設(shè)置為100%）。