TheWell Bioscience--人類胰腺癌細胞（PANC - 1）在VitroGel 系統上的3D細胞培養

【介紹】

3D培養已成為在體外研究復雜系統（如腫瘤微環境（TME））的標準。這些系統有助于深入了解體內發生的細胞與細胞相互作用和信息交流。使用3D基質模擬復雜的TME（2），甚至開始模擬轉移（3），通過提供細胞外基質（ECM）的成分并增強這些體外模型的生物學相關性（1，2）。傳統上，3D培養系統是在Matrigel 中建立的，它改變了癌癥體外研究的面貌，允許適當的細胞分化并組織成3D球體。盡管Matrigel系統的開發及時且具有創新性，但多年來遇到了多種并發癥（1，2）。其中包括批次間重現性困難，因為Matrigel 的ECM成分可能不同，實驗溫度控制困難，以及存在影響研究的生長因子或蛋白質。有了更具重現性的系統，就有可能擴展系統的復雜性并納入多種細胞類型，揭示關于細胞 -細胞相互作用/信號的信息（4）。這種對類似TME系統的深入了解將使研究人員能夠理解如何抑制甚至逆轉侵襲性癌癥的惡性表型（2）。因此，通過這個系統，對于開發一種可重現的、無動物源的3D系統來研究TME的需求，有了一個答案。

VitroGel 3D系統已用于多種細胞系的持續培養（2），包括最近對PANC - 1的研究。開發胰腺癌新療法的z大挑戰之一是在2D培養中對治療的高反應率，但在臨床上最終失敗。最近的工作揭示了在PANC - 1模型中3D球體形成所代表的體內樣TME，當比較2D和3D模型時，闡明了多種基質蛋白、細胞代謝和對藥物治療反應性的顯著改變（5）。結合我們對TME復雜性的理解，3D模型是在侵襲性和挑戰性模型（如PANC - 1）中進行全面體外藥物評估的理想選擇。在這里介紹的研究中，VitroGel系統的優勢允許均勻分布和球體形成，而沒有Matrigel或傳統水凝膠系統廣泛接受的警告，如支架結構不良、不需要的蛋白質/生長因子、預凝膠溶液的不良pH或溫度、復雜的操作步驟和困難的下游分析（1）。VitroGel 3D為3D細胞培養及其他提供了更快、更簡單和更通用的解決方案。VitroGel 3D是一種室溫穩定、無動物源、可調諧的水凝膠系統，緊密模擬ECM，允許細胞像在體內一樣生長。這個3D細胞培養系統的設置僅需20分鐘，包括10 - 15分鐘的等待時間，在此期間，水凝膠被激活并隨著含鈣或含鈉的細胞培養基的加入開始聚合。VitroGel 3D系統的多功能性允許進行2D和3D細胞培養、安全的體內使用以及通過系統的透明和可滲透性質輕松進行體外成像。此外，通過離心和移液可以輕松從VitroGel 3D系統中收集細胞，無需在細胞上使用降解酶。

【材料和方法】

VitroGel 3D - RGD細胞培養

為了評估在培養PANC - 1細胞時使用的水凝膠的適當濃度，將VitroGel 3D - RGD水凝膠（TWG002，TheWell Bioscience）與0.5X PBS溶液以1:0、1:1或1:3的比例（v:v）制備。然后將稀釋的水凝膠溶液與PANC - 1細胞懸液（在含有10％FBS + 1x pen - strep的DMEM培養基中接種密度為5 x 10^5細胞/ mL）以4:1（水凝膠：細胞）的比例混合。將250?L的水凝膠 - 細胞混合物添加到24孔板的每個孔中，并在室溫下穩定20分鐘。在固化步驟之后，將250?L完全細胞培養基添加到水凝膠的頂部。使用部分培養基更換方法以防止干擾水凝膠結構：在第2天，不是去除覆蓋培養基，而是向水凝膠的頂部培養基中額外添加200?L完全細胞培養基，并將細胞培養額外24至48小時。在這個孵育期后，每隔一天應更換水凝膠頂部60 - 70％的培養基。

活/死測定

8室蓋玻片載有125?L水凝膠和200?L覆蓋培養基。去除覆蓋培養基，并用PBS洗滌3次，然后按照制造商的方案使用LIVE/DEAD 細胞成像試劑盒（488/570）（ThermoFisher R37601）進行活/死評估。然后使用共聚焦顯微鏡拍攝圖像。免疫熒光：這些切片按照上述在8室蓋玻片中制備（125?L水凝膠和200?L覆蓋培養基）。去除覆蓋培養基，并用PBS洗滌3次，然后按照制造商的方案使用Image - iT 固定/透化試劑盒、ActinGreen?488 ReadyProbes 試劑和NucBlue 固定細胞ReadyProbes 試劑（ThermoFisher）進行固定和染色。然后使用Leica TCS SP8掃描共聚焦顯微鏡和z - stack功能捕獲圖像。使用LAS X軟件和ImageJ進行圖像的處理和分析。

有關使用VitroGel 3D或VitroGel 3D - RGD系統的更多具體信息，請參考VitroGel用戶手冊（https://www.thewellbio.com/wp - content/uploads/2018/05/VitroGel - 3D - Protocol - Guidelines.pdf）。

【結果和討論】

PANC - 1細胞在0.5X PBS中以1:0、1:1和1:3的濃度遞增稀釋的水凝膠溶液中培養。在第1天（圖1，第1天），3D細胞培養在比例之間沒有顯示出差異；簡單地說，在每種條件下，細胞都能夠在水凝膠內均勻分布（圖1）。當細胞培養至第7天時，基于水凝膠的濃度觀察到顯著差異（圖1，第7天）。在每種條件下，單個細胞形成集落并聚集，然而，水凝膠與PBS的1:1和1:3稀釋比允許單個細胞更快地分裂和擴展，形成更大的3D集落，如圖1所示，其中藍色核比其他兩種條件下更多。

圖1：第1天（左）和第7天（右）PANC - 1細胞在VitroGel 3D - RGD的三種不同稀釋度下的代表性熒光顯微照片，以及相應的抗體染色：NucBlue（核）和ActinGreen（肌動蛋白）。

3D培養系統的另一個關鍵組成部分來自于ECM的發展，它可以重現體內所見。在圖2中查看ActinGreen / NucBlue染色的放大視圖，揭示了在VitroGel 3D - RGD水凝膠中維持的PANC - 1細胞的細胞 - 細胞接觸所產生的ECM的復雜性和分散性增加。這些結果表明，在1:3稀釋的水凝膠中，PANC - 1 3D球體的生長速率和復雜性高于1:0和1:1水凝膠稀釋度（圖2）。

圖2：第7天PANC - 1細胞在VitroGel 3D - RGD的三種不同稀釋度下的代表性和放大（底部）熒光顯微照片，以及相應的抗體染色：NucBlue（核）和ActinGreen（肌動蛋白）。

培養3D球體的一個擔憂來自于球體中心可能會壞死的觀念（6）。在這項研究中，用活/死測定評估球體。該評估顯示在三種水凝膠稀釋度中均沒有顯著的死亡（圖3）。

圖3：在第7天，不同水凝膠強度濃度下的活/死測定，顯示活細胞為綠色，死細胞為紅色。

【結論】

VitroGel 3D - RGD系統是一種方便、時效高且成本低的系統，允許對在3D系統中生長的細胞的形態和行為進行準確和可重現的研究，而無需擔心溫度敏感性或額外的生物成分。評估VitroGel 3D - RGD系統與PANC - 1細胞的結果表明，對于這種細胞類型，用0.5X PBS稀釋水凝膠在檢查簇的大小和肌動蛋白定位時產生了更強大的PANC - 1球體。這些有希望的結果是驗證一個系統的第一步，該系統現在可以在藥物篩選研究中呈指數級擴展，并為臨床提供信息，可能為在體外使用3D測定法使用患者細胞來了解特定疾病如何對治療做出反應提供了有希望的一步。

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