Calcein-AM是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，Calcein-AM由于在Calcein的基礎(chǔ)上加強了疏水性，因此能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會將其水解為Calcein留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM是最適合作為熒光探針去染活細(xì)胞的，因為它的細(xì)胞毒性很低。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長分別為490nm和515nm。   

Calcein,AM僅對活細(xì)胞染色。作為核染色染料的PI不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，它穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(激發(fā)：488,545nm，發(fā)射：617nm)，因此PI僅對死細(xì)胞染色。  

由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。根據(jù)以上特點，Calcein AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用來作為活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。   

今天就給大家?guī)硪豢罨贑alcein AM和PI的活死細(xì)胞雙染試劑盒(B-CHK103)，本染色方法適用于熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀等微孔板熒光掃描設(shè)備、流式細(xì)胞儀或其他的熒光設(shè)備。本染色方法適用于大多數(shù)真核細(xì)胞，包括貼壁細(xì)胞和某些組織樣本，但不包括細(xì)菌和酵母樣本。   

需要注意的是Calcein AM/PI雙染有效染色的前提是相應(yīng)的細(xì)胞模型的活力變化是指酶活性變化和質(zhì)膜完整性變化這些物理和生化特性，不影響這些細(xì)胞特性的細(xì)胞毒性事件可能不能使用此方法進(jìn)行準(zhǔn)確評估。 

不同檢測平臺的建議步驟：

熒光顯微鏡檢測：

• 準(zhǔn)備樣本細(xì)胞。

• 用PBS洗滌細(xì)胞2～3次。

• 用100～150μL染色工作液A至蓋玻片將細(xì)胞樣品覆蓋(或重懸)。

• 在室溫或37℃避光孵育20～45分鐘。

• 用PBS洗滌細(xì)胞。

• 用100～150μL染色工作液B至蓋玻片將細(xì)胞覆蓋(或重懸)。

• 在室溫或37℃避光孵育10～45分鐘。

• 用PBS洗滌細(xì)胞。

• 用熒光顯微鏡檢測結(jié)果。最大激發(fā)為490nm，最大發(fā)射波長分別為515nm和617nm。

流式細(xì)胞儀檢測：

• 收集細(xì)胞：可以用胰酶-EDTA等消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。

• 用PBS洗滌細(xì)胞兩次。

• 制備1mL細(xì)胞懸浮液，濃度為0.1至5×10⁶細(xì)胞/mL。細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基或其他緩沖液中重懸。

• 在細(xì)胞中加入適量Calcein-AM溶液和適量PI母液，混勻。

• 在室溫或37℃避光孵育15～30分鐘。

• 盡快用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。

熒光酶標(biāo)儀檢測：

• 在微孔板中準(zhǔn)備細(xì)胞樣本孔以及對照孔。

• 用PBS洗滌細(xì)胞2～3次。

• 加入200μL染色工作液。

• 在室溫或37℃避光孵育15～45分鐘.

• 用PBS洗滌細(xì)胞。

• 加入適量PBS。

• 用熒光酶標(biāo)儀/熒光光度計檢測結(jié)果。最大激發(fā)波為490nm，最大發(fā)射波長為525nm和617nm。

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