在病毒診斷中，核酸擴增測試，例如逆轉(zhuǎn)錄PCR反應 (RT-PCR)，可以及早發(fā)現(xiàn)和識別逆轉(zhuǎn)錄病毒導致的傳染病。在這個標準 PCR 過程中，作為初始模板的 mRNA 首先被逆轉(zhuǎn)錄為互補 DNA (cDNA)，然后通過 PCR 擴增以進行下游分析。相對于其他測量 mRNA 的技術(shù)，例如 Northern Blot、RNAse 保護分析或熒光原位雜交，RT-PCR 在檢測任何基因的 RNA 轉(zhuǎn)錄物時明顯更加有優(yōu)勢。RT-PCR 已成為檢測病原體的常規(guī)方法，包括流感病毒、腸道病毒、冠狀病毒 (SARS-CoV-2)、埃博拉病毒和 HIV等。

1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒

逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種遺傳物質(zhì)為RNA的病毒，與其他病毒類似，逆轉(zhuǎn)錄病毒通過劫持細胞中的細胞器進行自身的復制。病毒感染細胞后，逆轉(zhuǎn)錄病毒利用其自身的逆轉(zhuǎn)錄酶從其 RNA 基因組中合成雙鏈 DNA。新合成的病毒 DNA 被整合到宿主細胞基因組中，然后病毒的遺傳物質(zhì)作為宿主細胞 DNA 的一部分一起進行復制。

在人類歷史上，出現(xiàn)過許多導致嚴重的疾病的逆轉(zhuǎn)錄病毒：HIV-1 和 HIV-2 等逆轉(zhuǎn)錄病毒會導致艾滋病，而人類 T 淋巴細胞病毒會導致白血病（即血癌）和脫髓鞘病。這些嚴重的疾病和新出現(xiàn)的傳染病的持續(xù)威脅，再次證實了開發(fā)能夠檢測低密度感染的快速診斷工具是多么的有必要的，用于早期檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的最完善的工具之一是核酸擴增檢測。

2. 核酸擴增試驗

核酸擴增檢測旨在檢測少量特定核酸序列，以識別特定病原體，通常是病毒或細菌。核酸擴增測試不是檢測抗原或抗體（血清學分析的目標），而是針對并檢測遺傳物質(zhì)，例如 DNA 或 RNA。遺傳物質(zhì)的檢測允許在血清轉(zhuǎn)化之前對感染進行早期診斷，在此期間，特異性抗體針對病原體產(chǎn)生并在血液中可檢測到。常見的核酸擴增檢測包括RT-PCR、鏈置換試驗 (SDA) 或轉(zhuǎn)錄介導試驗 (TMA)。

逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 是一種用于檢測和定量 mRNA 表達水平的高度靈敏的技術(shù)。在 RT-PCR 中，首先使用逆轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 模板逆轉(zhuǎn)錄為互補 DNA (cDNA)。這種依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶在逆轉(zhuǎn)錄引物、脫氧核苷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP）的幫助下，催化從其各自的目標 RNA 序列合成 cDNA。然后將 cDNA 用標準 PCR 程序（變性、退火和延伸）進行指數(shù)擴增然后再進行檢測。RT-PCR 已被用于多種應用，包括基因表達分析、微陣列驗證、病原體檢測和疾病研究。

RT-PCR產(chǎn)物的定量一般可分為兩類：終點RT-PCR和定量RT-PCR（RT-qPCR）。

表1. 用于 PCR、RT-qPCR 和RT-PCR 的脫氧核苷酸 (dNTP)

3. 終點RT-PCR

終點 RT-PCR 是分析基于 PCR 反應的平臺期，用于在 PCR 反應的所有循環(huán)完成后分析擴增產(chǎn)物的技術(shù)，在該方法中，擴增子通過瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用 DNA 結(jié)合染料（如溴化乙錠 (EtBr)）進行可視化，用來確定 500至30,000 bp 范圍內(nèi)的 DNA 分子大小。雖然 EtBr 是最常用的 DNA 可視化染料，但它具有致突變性和吸入毒性。因此，可以考慮使用更安全、更環(huán)保、無毒的替代品，例如 Gelite X100（貨號：17706）、Helixyte Green（貨號：17590）、Helixyte Gold（貨號：17595）、Gelite Green（貨號：17589 ) 或 Gelite Orange（貨號：17594）。

表 2. 終點RT-PCR的優(yōu)缺點及應用

表 3. 用于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳的核酸染料

4. RT-qPCR

在定量 RT-PCR (RT-qPCR) 中，熒光標記的核苷酸或序列特異性熒光探針被整合到 RT-PCR 反應中，允許在 PCR 的指數(shù)階段實時測量目的基因的濃度。實現(xiàn)了將擴增和檢測結(jié)合到一個步驟中，RT-qPCR 提供了更高的精確度和準確度。由于擁有更高的靈敏度，RT-qPCR 通常用于分析基因表達中的 mRNA、檢查逆轉(zhuǎn)錄病毒的存在以及驗證通過陣列分析獲得的結(jié)果。

墻裂推薦：用于 RT-qPCR 的 Helixyte Green染料

RT-qPCR 使用熒光 DNA 嵌入染料，例如 Helixyte Green（貨號17591) 為實時檢測和定量 PCR 擴增子提供了最簡單、最經(jīng)濟的方法。Helixyte Green 可以與雙鏈 DNA (dsDNA) 結(jié)合，并在激發(fā)時發(fā)光。 連續(xù)擴增循環(huán)使目的基因的濃度增加，Helixyte Green 的熒光強度也會增加，其程度與每個 PCR 循環(huán)中存在的 dsDNA 量成正比。Helixyte Green 是EtBr 更安全的替代品，也擁有更高的靈敏度，可用于檢測任何 dsDNA 序列的擴增。（Note：由于 DNA 嵌入染料會與所有的 dsDNA 結(jié)合，例如引物二聚體和非特異性產(chǎn)物，因此使用精心設(shè)計的引物以避免擴增非特異性序列非常重要。）

表 4. 用于 qPCR 的雙鏈 DNA 結(jié)合染料

5. 用于 RT-qPCR 的 TaqMan? 探針和分子信標

在基于探針的 RT-qPCR 中，熒光標記的目的基因特異性探針可用于實時監(jiān)測 DNA 的擴增。這種方法具有極高的特異性，并可以在單個反應中同時檢測多個目標，在諸多的基于探針的 RT-qPCR 檢測方法中，TaqMan 探針和分子信標是使用最廣泛的，兩者都依賴于 Frster 共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 來產(chǎn)生熒光信號：TaqMan 探針依賴于Taq DNA 聚合酶的 5'-核酸酶活性，與靶標互補的短寡核苷酸序列在 5' 端用熒光報告染料標記（見表 5），在 3' 端用非熒光猝滅染料標記（見表 6），在 PCR 循環(huán)期間，引物和探針與靶標退火，當 Taq DNA 聚合酶與探針上游的引物結(jié)合并延伸時，雜交的探針被水解，含有報告染料的片段被釋放，然后就可以檢測熒光信號，產(chǎn)生的熒光信號量與產(chǎn)生的 qPCR 產(chǎn)物量成正比。

與 TaqMan 探針一樣，分子信標在 5' 端用熒光報告染料標記，在 3' 端用非熒光淬滅染料標記。然而，該方法不依賴于Taq DNA 聚合酶的 5' 核酸酶活性來產(chǎn)生信號，而是分子信標在整個擴增過程中都保持完整，在沒有靶標的情況下，分子信標由于其自我互補的莖環(huán)結(jié)構(gòu)而依然保持在“發(fā)夾”確認狀態(tài)，這使熒光報告基因和淬滅染料彼此靠近，防止探針發(fā)熒光。當分子信標與其靶標雜交時，熒光報告基團和淬滅基團分離，報告染料在特定波長處發(fā)光。

我們提供一系列的染料標記的亞磷酰胺和染料 CPG 支持物，便于開發(fā) FRET 寡核苷酸、TaqMan 探針和分子信標。染料類型包括各種經(jīng)典染料，例如 FAM、HEX、TET 和 JOE，以及全新的寡標記染料，例如 Tide Fluor 和 Tide Quencher 染料。

表 5. 用于標記qPCR 探針的報告熒光染料

表 6. 用于標記qPCR 探針的淬滅染料

表 7. 用于開發(fā) FRET 寡核苷酸的推薦FRET 熒光對

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