【Mabtech明星產(chǎn)品之前情回顧】：

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酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) (enzyme linked immunospot assay, ELISpot) 是一種在96孔板內(nèi)的一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)分泌細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)的新型的免疫酶技術(shù)。靈敏度高，易操作，成本相對(duì)流式細(xì)胞術(shù)較低，已被廣泛應(yīng)用于癌癥研究，疾病探索以及疫苗研發(fā)等領(lǐng)域。

ELISpot原理：將細(xì)胞置于包被有特異性抗體的96孔板中培養(yǎng)，在有刺激的條件下，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或免疫球蛋白會(huì)被包被抗體捕獲。移除細(xì)胞后，被捕獲的細(xì)胞因子可進(jìn)一步使用生物素標(biāo)記的二抗來(lái)標(biāo)識(shí)，其后再與酶標(biāo)記的親和素作用，并加入底物使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會(huì)留下直徑大小不等的染色斑點(diǎn)。

1. 加入細(xì)胞到含有（或不含）刺激物中培養(yǎng)；

2. 陽(yáng)性細(xì)胞開始分泌細(xì)胞因子，細(xì)胞因子就近被包被抗體捕獲；

3. 移出細(xì)胞，清洗板子，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，形成“抗體-抗原-抗體”夾心結(jié)構(gòu)；

4. 為了觀察膜上斑點(diǎn)的形成，加入酶標(biāo)記的親和素；

5. 加入顯色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn)；

6. 斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（可人工計(jì)數(shù)，也可用自動(dòng)讀板儀計(jì)數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。

常見(jiàn)疑難問(wèn)題解答：

1. 您推薦哪種ELISpot板子？

我們建議使用PVDF膜的96孔ELISpot板子，有效結(jié)合大量捕獲抗體，前提是膜用乙醇預(yù)處理（即活化）。

2. 板的顏色是否重要，我應(yīng)選擇白色板子還是透明板子？

白色和透明ELISpot板具有相同類型的PVDF膜。這兩種顏色在讀板儀中略有不同，但并不重要。（如果有沒(méi)有添加液體的漏掉的孔，透明的板子很容易看見(jiàn)。）

3. 包被前為什么要用乙醇對(duì)ELISpot板進(jìn)行預(yù)處理？

ELISpot板子的膜具有多孔疏水結(jié)構(gòu)。為了使大量捕獲抗體能夠結(jié)合，應(yīng)該用乙醇處理膜以使其親水。這是獲得高質(zhì)量斑點(diǎn)所必需的致密抗體包被層。ELISpot板子的逐步預(yù)包被和EtOH處理的protocol，歡迎點(diǎn)擊了解。

4. 如何清洗和清空ELISpot板？

可以使用多通道移液器手動(dòng)清洗板子。在不需要無(wú)菌條件的洗滌步驟中，可以使用常規(guī)ELISA板洗滌器，條件是洗滌頭適合于ELISpot板。將盤子倒置在廢物容器上，將盤子倒空。當(dāng)手動(dòng)清空板子時(shí)，確保液體不會(huì)從廢物容器中“濺出”。當(dāng)盤子已經(jīng)清空時(shí)，可以將其倒置在干凈的紙巾上，以從孔中除去殘留的液體。對(duì)于底物反應(yīng)后的最終洗滌，可以用自來(lái)水沖洗BCIP/NBT-Plus，去離子水或蒸餾水沖洗TMB。

5. 什么是預(yù)涂ELISpot板？

用于ELISpot和FluoroSpot的預(yù)包被板子可隨時(shí)使用，因?yàn)樗鼈冊(cè)跓o(wú)菌條件下和全自動(dòng)程序下涂有最佳濃度的捕獲抗體。預(yù)包被板提供了方便的選擇，因?yàn)樗恍枰掖碱A(yù)處理和抗體包被過(guò)程。還可以最大限度地減少由于手動(dòng)包被程序的變化而可能出現(xiàn)的變化。

6. 包被抗體溶液可以在ELISpot板中保存多長(zhǎng)時(shí)間？

如果使用無(wú)菌板子并且防止蒸發(fā)（例如通過(guò)將板子包裹在封口膜中），則可以在冰箱中將包被抗體溶液的板子長(zhǎng)達(dá)一周。重要的是孔不干燥。以這種方式存儲(chǔ)的板的功能應(yīng)由用戶評(píng)估。

7. 冷凍細(xì)胞可以用于ELISpot嗎？

冷凍保存的細(xì)胞非常適合ELISpot。然而，其結(jié)果取決于細(xì)胞的質(zhì)量，必須建立冷凍/解凍的程序以產(chǎn)生具有高活力的細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)冷凍程序應(yīng)包括使用DMSO和胎牛血清或類似物，并逐步冷凍程序。

8. 在ELISpot中每孔使用多少個(gè)細(xì)胞？

必須將每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為細(xì)胞類型和分泌細(xì)胞的預(yù)期頻率。如果頻率非常低，例如10,000個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)，則需要更多數(shù)量的細(xì)胞，通常約250,000個(gè)細(xì)胞/孔。當(dāng)分泌細(xì)胞的頻率高時(shí)，例如10個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)，約5,000個(gè)細(xì)胞/孔就足夠了。細(xì)胞數(shù)量在測(cè)定中并不總是顯示線性，因?yàn)樾枰?xì)胞-細(xì)胞的最佳接觸，例如抗原呈遞細(xì)胞的充分刺激。當(dāng)分析抗原特異性T細(xì)胞時(shí)，PBMC不應(yīng)低于每孔200,000個(gè)細(xì)胞。

我們通常不建議使用超過(guò)500,000個(gè)細(xì)胞/孔，因?yàn)檫@可能產(chǎn)生多個(gè)細(xì)胞層，反過(guò)來(lái)由于細(xì)胞和ELISpot膜之間的距離增加而導(dǎo)致斑點(diǎn)質(zhì)量降低。

9. 可以在ELISpot中使用人血清嗎？

由于以下原因，我們不建議在ELISpot中使用人血清。當(dāng)分析人類樣品時(shí)，感興趣的分析物（例如IFN-γ或IgG）實(shí)際上可能存在于血清中。由于分析物將與捕獲和檢測(cè)抗體結(jié)合，因此會(huì)導(dǎo)致膜變暗。人血清可能含有嗜異性抗體，其可與來(lái)自許多物種的Ig交叉反應(yīng)。這種反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致雙抗夾心免疫檢測(cè)中抗體交聯(lián)的問(wèn)題。在ELISpot中，它將導(dǎo)致膜的普遍變暗。

10. 為什么TMB斑點(diǎn)在運(yùn)行測(cè)試后一天內(nèi)會(huì)變黃或幾乎消失？

在極少數(shù)情況下，當(dāng)使用自來(lái)水進(jìn)行最后的洗板時(shí)，通常不同的藍(lán)色TMB斑點(diǎn)可能會(huì)變成難以看見(jiàn)的黃色。這是由水中高含量的離子化合物引起的。如果不確定水質(zhì)，我們建議用去離子水或蒸餾水沖洗板以停止底物反應(yīng)。ALP酶和BCIP / NBT-plus底物沒(méi)有類似的問(wèn)題。

11. 我看到對(duì)照孔中沒(méi)有細(xì)胞和刺激的小的非特異性斑點(diǎn)，為什么？

非特異性斑點(diǎn)很少見(jiàn)，但可能會(huì)發(fā)生。一個(gè)原因是生物素化抗體中的聚集物可以在儲(chǔ)存后發(fā)生。其他原因包括試劑或緩沖液中的污染物或灰塵。為了減少非特異性背景，建議過(guò)濾（0.2μm）檢測(cè)mAb的工作稀釋液。

12. 在ELISpot孔內(nèi)部的細(xì)胞分布不均勻，為什么？

如果在刺激物之前添加細(xì)胞，可能會(huì)變得這樣。我們不建議將刺激物和細(xì)胞混合在一起，然后一次性添加該溶液（細(xì)胞+刺激物）。

正確的方法是先加刺激物（懸空滴加），然后懸在孔的正上方，逐滴滴加細(xì)胞懸液(自然滴下)，此過(guò)程中要避免產(chǎn)生氣泡以及劇烈晃動(dòng)培養(yǎng)板。這樣細(xì)胞就能依靠擴(kuò)散的原理，均勻的分布在孔板內(nèi)，避免了貼壁細(xì)胞產(chǎn)生。

注意：一定不要拍擊板子來(lái)讓細(xì)胞混勻，那樣會(huì)適得其反。

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Mabtech公司于1986年創(chuàng)辦于瑞典，是一家歐洲的集研究，開發(fā)，銷售，技術(shù)支持為一體的高科技免疫生物技術(shù)公司。Mabtech公司始終專業(yè)致力于研發(fā)新的單克隆抗體，生產(chǎn)創(chuàng)新的免疫試劑和銷售高品質(zhì)的全配套的免疫試劑盒。公司核心業(yè)務(wù)是致力于優(yōu)化發(fā)展酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法技術(shù) (ELISpot)、熒光免疫斑點(diǎn)法技術(shù) (FluoroSpot) 和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù) (ELISA) 等免疫學(xué)方法。公司開發(fā)和生產(chǎn)多種針對(duì)細(xì)胞因子，免疫球蛋白和載脂蛋白的單克隆抗體，用于生命科學(xué)研究中的體外應(yīng)用。Mabtech的試劑盒可用于研究感染性疾病，癌癥，過(guò)敏，移植等免疫反應(yīng)，通常用作疫苗試驗(yàn)中的監(jiān)測(cè)工具。此外，還生產(chǎn)用于獸醫(yī)和心血管研究的試劑盒。

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