前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是全球男性最常見的癌癥之一，其致死率也相當(dāng)高。盡管存在手術(shù)、化療、放療等多種治療手段，但這些方法的有效性和安全性仍有待提升。特別是在解決化療耐藥性和減少副作用方面，需要更深入的研究和新的治療策略。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，通過基因敲除來研究癌癥相關(guān)基因的功能變得更為直接和高效。 

“CRISPR/Cas9-mediated knockout of Lcn2 effectively enhanced CDDP-induced apoptosis and reduced cell migration capacity of PC3 cells”利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在高度侵襲性和激素難治性的前列腺癌細(xì)胞系PC3中敲除了Lcn2基因，并評估了這一操作對細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響，尤其是在與化療藥物順鉑（CDDP）聯(lián)合使用時的效果。

為了研究Lcn2在高度侵襲性的前列腺癌細(xì)胞系即PC3中的致癌作用，最初通過CRISPR/Cas9技術(shù)在PC3細(xì)胞中敲除了Lcn2表達(dá)。研究的示意圖如上圖。  

方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞系：使用人前列腺癌細(xì)胞系PC3。

培養(yǎng)基：細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染：利用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑（貨號HD-1000， FuGENE? HD Transfection Reagent）將Lcn2 CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒、同源定向修復(fù)質(zhì)粒或?qū)φ誄RISPR/Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至PC3細(xì)胞中。具體步驟包括細(xì)胞接種、質(zhì)粒混合、Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑孵育、更換含嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基等。  

2. 基因敲除驗證

RNA提取與RT-PCR：提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR檢測Lcn2的mRNA表達(dá)水平。

免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）：使用Lcn2特異性抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，確認(rèn)Lcn2蛋白的敲除水平。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：通過ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中Lcn2蛋白的濃度，進(jìn)一步確認(rèn)敲除效果。 

3. 細(xì)胞增殖與凋亡檢測

WST-1試驗：利用WST-1試劑檢測細(xì)胞增殖能力。

克隆形成試驗：評估細(xì)胞在長時間培養(yǎng)后的增殖潛力。

凋亡檢測：通過DAPI染色、TUNEL試驗和細(xì)胞死亡檢測ELISA plus方法評估CDDP處理后的細(xì)胞凋亡情況。  

4. 細(xì)胞遷移能力檢測

劃痕試驗（Wound Healing Assay）：通過在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞遷移填補劃痕的速度。

Transwell遷移試驗：評估細(xì)胞通過含小孔濾膜的遷移能力。  

實驗結(jié)果

1. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Lcn2敲除抑制PC3細(xì)胞增殖

通過RT-PCR、ICC和ELISA方法確認(rèn)Lcn2基因在mRNA和蛋白水平上的敲除成功后，發(fā)現(xiàn)Lcn2敲除顯著抑制了PC3細(xì)胞的增殖能力。WST-1試驗和克隆形成試驗均表明，Lcn2敲除細(xì)胞的增殖速度明顯慢于對照細(xì)胞。  

2. Lcn2敲除增強PC3細(xì)胞對CDDP的敏感性

Lcn2敲除后，PC3細(xì)胞對CDDP的敏感性顯著增強。不同濃度的CDDP處理顯示，Lcn2敲除細(xì)胞在較低濃度的CDDP下即表現(xiàn)出更強的細(xì)胞毒性反應(yīng)。  

3. Lcn2敲除促進(jìn)CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

通過DAPI染色、TUNEL試驗和細(xì)胞死亡檢測ELISA plus方法，均觀察到Lcn2敲除細(xì)胞在CDDP處理后的凋亡率顯著高于對照細(xì)胞。這表明Lcn2敲除可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來增加PC3細(xì)胞對CDDP的敏感性。  

4. Lcn2敲除減少PC3細(xì)胞的遷移能力

劃痕試驗和Transwell遷移試驗結(jié)果顯示，Lcn2敲除細(xì)胞的遷移能力顯著低于對照細(xì)胞。這表明Lcn2在PC3細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮重要作用。

結(jié)論

本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除了PC3細(xì)胞中的Lcn2基因，發(fā)現(xiàn)這一操作顯著抑制了細(xì)胞的增殖能力，并增強了細(xì)胞對CDDP的敏感性，促進(jìn)了CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，Lcn2敲除還顯著降低了PC3細(xì)胞的遷移能力。這些結(jié)果表明，Lcn2不僅是一個有價值的生物標(biāo)志物，還可能是前列腺癌治療的一個新靶點。通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Lcn2，結(jié)合化療藥物使用，可能成為一種新的前列腺癌治療策略。 

Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)勢

在本研究中，F(xiàn)ugene HD轉(zhuǎn)染試劑發(fā)揮了關(guān)鍵作用，確保了CRISPR/Cas9質(zhì)粒高效、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入PC3細(xì)胞。其優(yōu)點包括：

高效性：Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑能夠顯著提高質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率，使得更多的細(xì)胞成功接收并表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，從而增加Lcn2基因的敲除效率。

穩(wěn)定性：該試劑能夠穩(wěn)定地保持質(zhì)粒DNA在細(xì)胞培養(yǎng)液中的分散狀態(tài)，減少質(zhì)粒的聚集和降解，確保長時間內(nèi)細(xì)胞能夠持續(xù)接受質(zhì)粒DNA的刺激。

低毒性：與其他轉(zhuǎn)染試劑相比，F(xiàn)ugene HD的細(xì)胞毒性較低，能夠減少對細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞的存活率和轉(zhuǎn)染后的生理狀態(tài)，從而確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

易用性：Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑的使用步驟相對簡單，不需要復(fù)雜的操作技巧，適合實驗室常規(guī)使用。   

因此，F(xiàn)ugene HD轉(zhuǎn)染試劑在CRISPR/Cas9基因編輯實驗中具有不可替代的作用和價值，為基因功能研究和疾病治療提供了新的技術(shù)手段。