您可能聽說過這樣的說法：“所有美好的事物終將結(jié)束”——尤其是在珍貴的原代細(xì)胞培養(yǎng)物在幾次傳代后達(dá)到衰老狀態(tài)時(shí)。然而，得益于永生化細(xì)胞系的開發(fā)，這種情況已不再如此！在本文中，我們將介紹：

一．什么是永生化細(xì)胞？

您可能習(xí)慣于使用直接從活體組織中提取的細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞的難點(diǎn)在于，每次細(xì)胞分裂后，它們的端粒都會(huì)縮短，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)并停止分裂，僅經(jīng)過幾個(gè)細(xì)胞周期。這意味著如果您正在進(jìn)行長(zhǎng)期項(xiàng)目，您將經(jīng)常需要不斷收獲和重新建立新的原代細(xì)胞批次。此外，由于不同的收獲條件，每個(gè)細(xì)胞批次都是不同的，這使得可重復(fù)性成為一個(gè)問題！ 

永生化細(xì)胞（也稱為連續(xù)細(xì)胞或細(xì)胞系）是端粒和/或腫瘤抑制基因已經(jīng)被改變的原代細(xì)胞。腫瘤抑制基因（例如p53和Rb）對(duì)于在DNA損傷的可能性更高時(shí)（即在多個(gè)細(xì)胞周期后，更多關(guān)于細(xì)胞周期的信息請(qǐng)?jiān)L問我們的知識(shí)庫(kù)）向細(xì)胞發(fā)出停止分裂的信號(hào)非常重要。在永生化細(xì)胞的情況下，這些基因已經(jīng)被抑制或其功能被抑制，使細(xì)胞能夠無限期地繼續(xù)分裂。

圖1 -端粒是DNA的重復(fù)區(qū)域，形成染色體末端的保護(hù)“帽”，保護(hù)染色體免受退化。經(jīng)過每一輪細(xì)胞周期，這些端粒會(huì)變短，Z終導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入衰老階段，細(xì)胞停止分裂。  

理想的永生化細(xì)胞具有與其親本組織相似的基因型和表型。一些實(shí)驗(yàn)室使用相同的永生化細(xì)胞數(shù)十年，因此，它們的細(xì)胞系已經(jīng)被很好地表征，并為其長(zhǎng)期項(xiàng)目提供了一致的基線。Z古老和Z常用的人類細(xì)胞系是HeLa細(xì)胞系，該細(xì)胞系是在20世紀(jì)50年代從宮頸癌細(xì)胞中建立的！但是，正如您將在本文的質(zhì)量控制部分看到的，檢查細(xì)胞系的身份以確保您的細(xì)胞系是您認(rèn)為的那樣是非常重要的。

二．細(xì)胞永生化策略

那么，您如何工程化一個(gè)永生化細(xì)胞系呢？有兩種主要方法：

方法A：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白（TERT）表達(dá)

TERT蛋白是端粒酶的催化亞基，在大多數(shù)體細(xì)胞中通常不活躍。在這種方法中，您可以將編碼人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感興趣的原代細(xì)胞中。當(dāng)hTERT被外源性表達(dá)時(shí)，細(xì)胞能夠維持足夠的端粒長(zhǎng)度以避免衰老。這是最近開發(fā)用于細(xì)胞永生化的方法。

方法B：病毒致癌基因

病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通過抑制腫瘤抑制基因（例如p53和Rb）來實(shí)現(xiàn)永生化。這種方法比方法A更快地生效，但可能會(huì)改變一些細(xì)胞的特性。

在許多情況下，單獨(dú)使用方法A和B可能不足以成功實(shí)現(xiàn)永生化。最近的研究發(fā)現(xiàn)，共同表達(dá)hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并產(chǎn)生更真實(shí)和正常的細(xì)胞模型，具有明確定義的遺傳背景。

圖2展示了正常細(xì)胞的典型壽命（綠色箭頭）。每次分裂，端粒縮短，直到最終達(dá)到所謂的衰老狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞停止復(fù)制并死亡。通過過度表達(dá)或抑制特定基因（例如破壞p53和RB途徑），我們可以逆轉(zhuǎn)或抑制端粒縮短，使細(xì)胞繼續(xù)分裂而不達(dá)到衰老。

表1：本表展示了常見的永生化方法。每種機(jī)制都涉及破壞圖2中顯示的復(fù)制過程中的關(guān)鍵基因。右列描述了abm的永生化試劑系列中可用的形式。您可以在我們的知識(shí)庫(kù)上閱讀有關(guān)不同病毒的更多信息。 

三．永生化工作流程概述

圖3：基本的細(xì)胞系永生化工作流程。

細(xì)胞系質(zhì)量控制考慮

太好了！在這個(gè)階段，您已經(jīng)生成了一個(gè)永生化細(xì)胞系。但是，在您開始在項(xiàng)目中使用您的細(xì)胞系之前，有一些重要的質(zhì)量控制檢查您可以進(jìn)行，以確保您的細(xì)胞系處于完美狀態(tài)。

A.您的細(xì)胞系表征

每次永生化后，您應(yīng)該始終檢查您的細(xì)胞是否具有適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，以及細(xì)胞的功能，以確保它代表您所使用的原代細(xì)胞。當(dāng)您研究細(xì)胞途徑時(shí)，這一步尤為重要，因?yàn)槟幌Ｍ郎襟E改變了特定途徑、功能或細(xì)胞的表型。 例如，如果您計(jì)劃使用您的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定，那么使用您的永生化細(xì)胞與原代細(xì)胞一起進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定是個(gè)好主意，以確保您新永生化的細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)與它們的原始細(xì)胞相似。

B.傳代和轉(zhuǎn)基因表達(dá)測(cè)試

將您的細(xì)胞傳代至少30次，以證明轉(zhuǎn)基因已穩(wěn)定表達(dá)，并觀察它們的生長(zhǎng)速度已提高，密度能力已增加。

C.STR分析

正如本文開頭提到的，驗(yàn)證您的細(xì)胞系身份至關(guān)重要，因?yàn)榭赡軙?huì)發(fā)生交叉污染或種群混合的問題。例如，根據(jù)《科學(xué)》雜志上發(fā)表的一篇論文，廣泛用于實(shí)驗(yàn)室的著名HeLa細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)污染了許多細(xì)胞系，包括Hep-2和INT407細(xì)胞系。 

識(shí)別細(xì)胞系的黃金標(biāo)準(zhǔn)是短串聯(lián)重復(fù)（STR）分析。STR分析是一種方法，其中在特定位點(diǎn)的短串聯(lián)DNA重復(fù)與標(biāo)準(zhǔn)參考配置文件進(jìn)行比較。細(xì)胞系的STR分析可以用來確認(rèn)其身份，定期進(jìn)行STR分析是個(gè)好主意，以確保您的細(xì)胞系沒有隨著時(shí)間的推移受到污染。 

為了應(yīng)對(duì)細(xì)胞系誤識(shí)別事件，資助機(jī)構(gòu)如NIH現(xiàn)在要求在資助申請(qǐng)中使用的細(xì)胞系進(jìn)行STR分析，許多期刊也開始鼓勵(lì)這個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)量控制檢查。

D.支原體和病原體檢測(cè)

最后，始終測(cè)試微生物污染物，如真菌、細(xì)菌和支原體是個(gè)好主意。特別是支原體，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中Z常見的污染物之一。通常很難通過顯微鏡下的視覺檢查來檢測(cè)支原體。然而，這種細(xì)菌可以影響細(xì)胞的增殖，改變其基因表達(dá)譜，并可能扭曲您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有許多試劑盒可用，例如abm的PCR支原體檢測(cè)和清除試劑盒，可以輕松檢測(cè)并清除50多種類型的支原體。   

我們希望本文能幫助您獲得開始您的第一個(gè)細(xì)胞永生化項(xiàng)目所需的信心！如果永生化過程聽起來太麻煩了，不用擔(dān)心——有許多細(xì)胞系庫(kù)可用，包括abm的500+永生化細(xì)胞系和800+獨(dú)特的細(xì)胞系，用于藥物發(fā)現(xiàn)，全球可用。您可以在這里查看我們的目錄或索取免費(fèi)的實(shí)體副本。沒有看到您正在尋找的特定細(xì)胞系，請(qǐng)查看下方表格（部分產(chǎn)品），或者請(qǐng)隨時(shí)與abm中國(guó)區(qū)代理，艾美捷科技聯(lián)系！400-6800-868，m.zihai029.com

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