細胞膜蛋白在細胞生物學和藥物發(fā)現(xiàn)中起著至關重要的作用。這些蛋白涉及多種生理功能，如運輸、信號傳導、細胞內(nèi)通訊和催化。由于它們在基本細胞過程中的核心角色，細胞膜蛋白成為有吸引力的藥物靶點，60%的FDA批準的藥物靶標都是細胞膜蛋白。然而，研究這些蛋白質(zhì)在復雜的細胞膜環(huán)境中的功能仍然是一個挑戰(zhàn)。為了更準確地模擬細胞環(huán)境，研究人員開發(fā)了多種實驗系統(tǒng)，包括巨型單層囊泡（GUVs）。GUVs由于其細胞大小的尺寸和內(nèi)部水相與外部環(huán)境的分離，為研究細胞膜蛋白提供了接近細胞的條件。

然而，傳統(tǒng)上制備GUVs的方法，如電形成法和融合預成GUVs的方法，往往需要使用去污劑，這可能對脆弱的蛋白質(zhì)造成損害。為了克服這一挑戰(zhàn)，研究人員探索了利用苯乙烯馬來酸共聚物（SMA）形成的脂質(zhì)納米盤（SMALPs）來制備GUVs的新策略。SMALPs能夠在不使用去污劑的情況下穩(wěn)定脂質(zhì)雙層，從而保留膜蛋白的天然脂質(zhì)環(huán)境。

《Lipid vesicle formation by encapsulation of SMALPs in surfactant-stabilised droplets》開發(fā)了一種創(chuàng)新方法，通過表面活性劑穩(wěn)定液滴作為模板，將SMALPs封裝在其中，進而形成GUVs。這種方法避免了使用去污劑，有望減少對膜蛋白的損害。

此示意圖展示了從苯乙烯馬來酸脂質(zhì)納米盤（Styrene Maleic Acid Lipid Particles, SMALPs）形成脂質(zhì)囊泡（Vesicles）的整體過程。

研究方法

在本研究中，研究者開發(fā)了一種利用表面活性劑穩(wěn)定液滴作為模板，從SMALPs制備GUVs的新方法。為了追蹤SMALPs與液滴界面上的表面活性劑之間的相互作用，作者們合成了一種新型熒光SMA變體（FSMA），將熒光素與SMA偶聯(lián)。以下是實驗方法的主要步驟：

FSMA的合成與表征：

將SMA與熒光素偶聯(lián)，制備FSMA。

使用FTIR對FSMA進行表征，確認熒光素的成功偶聯(lián)。

比較FSMA與SMA在形成納米盤時的效率，發(fā)現(xiàn)FSMA在較低濃度下與SMA表現(xiàn)相似，但在較高濃度下效率下降。

Krytox與FSMA/SMA的相互作用：

通過將FSMA/SMA溶液置于含有Krytox表面活性劑的油相上，評估其相互作用。發(fā)現(xiàn)Krytox濃度增加時，F(xiàn)SMA/SMA在油相中的存在量增加，表明Krytox與FSMA/SMA之間存在直接相互作用。

通過熒光顯微鏡觀察FSMA和FSMALPs在含有不同表面活性劑混合物液滴中的分布，進一步確認Krytox誘導FSMA在液滴界面上的積累。

GUV的形成與釋放：

使用不同脂質(zhì)組合、pH值、SMA濃度和表面活性劑混合物的SMALPs制備液滴。

通過添加脫乳劑（如PFO）釋放GUVs，并使用熒光顯微鏡評估釋放效率。

發(fā)現(xiàn)中性SMALPs在所有條件下均能形成GUVs，但釋放效率受SMA濃度、Krytox濃度和pH值影響顯著。

GUV的結(jié)構(gòu)與完整性評估：

使用負染色透射電子顯微鏡（TEM）和冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）觀察GUVs的形態(tài)和雙層結(jié)構(gòu)。

發(fā)現(xiàn)通過SMALPs形成的GUVs與電形成法得到的GUVs形態(tài)相似，但雙層結(jié)構(gòu)較為粗糙，存在孔隙。

使用熒光素滲漏實驗評估GUVs的完整性，發(fā)現(xiàn)小分子熒光素能迅速滲漏進入GUVs內(nèi)部，但大分子熒光素-葡聚糖滲漏較慢。

減少GUV滲漏的策略：

嘗試通過透析、離心濃縮器和polyhunter beads去除游離SMA，但未能顯著改善GUV的滲漏問題。

通過添加CaCl2或HCl使SMA聚合，雖然導致部分GUVs減少滲漏，但效果短暫。

將SMALPs與大型單層囊泡（LUVs）共擠出，再經(jīng)離心洗滌去除游離SMA，形成最終GUVs，有效減少滲漏。

在本文中，研究者使用了三種不同的方法來去除SMALPs溶液中的游離SMA，以減少GUV的滲漏問題。其中，使用Cube Biotech生產(chǎn)的polyhunter beads（cat#19103）作為一種去除游離聚合物的策略，被證明是嘗試性的一種手段，但并未顯著改善GUV的滲漏情況。盡管如此，polyhunter beads在以下幾個方面展示了其潛在的價值：

高效去除游離聚合物： Polyhunter beads專為去除溶液中的游離聚合物而設計，具有高效的吸附能力。在本文的實驗中，盡管未能完全解決GUV滲漏問題，但該方法為去除SMA提供了一種有效嘗試，為進一步優(yōu)化實驗條件提供了思路。

簡化實驗操作： 相比透析和離心濃縮器等方法，polyhunter beads的使用更為簡便快捷。它不需要復雜的設備支持，只需簡單的柱層析操作即可實現(xiàn)游離聚合物的去除，有助于提高實驗效率。

適用于多種應用場景： Polyhunter beads不僅限于本文所描述的去除SMA的應用，還可廣泛應用于生物制劑純化、藥物研發(fā)等領域，特別是在需要高效去除溶液中游離成分的場景中展現(xiàn)出其獨特優(yōu)勢。

促進科學研究與工業(yè)應用： 隨著生物技術和制藥工業(yè)的發(fā)展，對高效、穩(wěn)定的生物制劑和藥物遞送系統(tǒng)的需求日益增加。Polyhunter beads作為一種先進的純化工具，有助于促進相關領域的科學研究與工業(yè)應用，推動技術創(chuàng)新與發(fā)展。

備注：瓊脂糖珠，Cube Biotech還可以提供PolyHunter MagBeads磁珠

本文成功展示了利用SMALPs在表面活性劑穩(wěn)定液滴中組裝形成GUVs的可行性，并探討了影響GUV形成和釋放效率的多種因素。盡管通過FSMA的熒光特性揭示了GUV雙層結(jié)構(gòu)的粗糙性和孔隙問題，但通過多種策略嘗試減少滲漏問題表明，直接從SMALPs形成穩(wěn)定、完整的GUVs仍面臨挑戰(zhàn)。Polyhunter beads作為去除游離SMA的一種嘗試性手段，展示了其在生物制劑純化中的潛力，為進一步優(yōu)化實驗條件提供了新的思路。未來研究可探索更多有效的聚合物去除策略或新型納米盤形成材料，以實現(xiàn)更高效的GUV制備與應用。