【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機(jī)（一）——終點(diǎn)PCR

     【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機(jī)（二）——熒光定量PCR

       逆轉(zhuǎn)錄 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一種以 RNA 為樣本，RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ) DNA（cDNA），再以此為模板通過 PCR 進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。在實(shí)際應(yīng)用中，RT-PCR 分為一步法 RT-PCR 和兩步法 RT-PCR。整個反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過程有三個重要的因素，分別是RNA模板、反轉(zhuǎn)錄時所使用的引物類型、反轉(zhuǎn)錄酶 。

       RNA模板

      高質(zhì)量的 RNA 基本有幾個參數(shù)可供參考，首先是 OD260/280 以及 OD260/230的值應(yīng)該都是 2.0 左右，如果 OD260/280 小于 1.9，說明 RNA 中有一些蛋白質(zhì)的殘留，如果這個值大于 2.1，則很可能樣本中 RNA 有一定的降解。OD260/230如果小于 2.0，說明 RNA 中含有異硫氰酸胍，酚殘留，而這些物質(zhì)對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)影響是非常大的。另外就是瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整性，正常的 RNA一般呈現(xiàn)三條帶，即 5s、18s、28s，其各自的亮度呈現(xiàn)遞增狀態(tài)，依據(jù)物種不同可逆轉(zhuǎn)錄 PCR能存在些許差異。當(dāng) RNA 出現(xiàn)降解時，反饋?zhàn)蠲黠@的是 5s rRNA 的亮度顯著提高。下圖展示的分別是高質(zhì)量 RNA、稍有降解以及完全降解的實(shí)例：

       反轉(zhuǎn)錄引物

      提取到了高質(zhì)量的 RNA模板后，下一個需要考慮的問題便是引物的選擇了。通常，反轉(zhuǎn)錄引物有三類，分別是 oligodT、隨機(jī)引物和序列特異性引物：oligodT引物能特異性結(jié)合在含有 polyA 尾的 mRNA 末端起始反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但這一特性決定了它只能擴(kuò)增含有 polyA 尾的 mRNA，而且對 RNA 模板的質(zhì)量要求較高，一旦 polyA 尾發(fā)生降解，就不能被引物所識別，從而導(dǎo)致產(chǎn)物中沒有相應(yīng)基因的cDNA；隨機(jī)引物一般含有 6-9 個隨機(jī)序列的堿基，能夠隨機(jī)識別結(jié)合在 RNA 模板上，因此這類引物的優(yōu)點(diǎn)在于能同所有類型的 RNA 結(jié)合，而且比較適合于含有二級結(jié)構(gòu)的 RNA 及微量樣本，具有較高的反轉(zhuǎn)錄靈敏度。

      但缺點(diǎn)在于，結(jié)合的隨機(jī)性會造成 cDNA小片段較多，有時候還會對微量目的片段造成稀釋；序列特異性引物，顧名思義，針對于特定的序列設(shè)計的反轉(zhuǎn)錄引物，用于特異性的反轉(zhuǎn)錄某一段序列。在實(shí)際的應(yīng)用中，我們通常會研究同一個個體或細(xì)胞中不同基因表達(dá)水平的變化，因此序列特異性基因相對用的少一些。Solis BioDyn 可供的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液中可提供多種不同的引物（oligodT、隨機(jī)引物、以及 oligodT 與隨機(jī)引物的結(jié)合）供您選擇，滿足您的一切實(shí)驗(yàn)需求！

       逆轉(zhuǎn)錄酶

      Solis BioDyn 可提供兩種逆轉(zhuǎn)錄酶：分別是 MMLV（RNase H+）和 SOLIScript（RNase H-）逆轉(zhuǎn)錄酶。RNase H，是一種核糖核酸內(nèi)切酶，可以特異性地水解DNA-RNA 雜合鏈中的 RNA，不能水解單鏈或雙鏈 DNA 或 RNA。

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                  三點(diǎn)：

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                      六觀：

                  價值觀：激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越。