【應(yīng)用】

Aquarray, Leopoldshafen, Germany

TheWell Bioscience, North Brunswick, NJ 08902

【液滴微陣列平臺(tái)】

液滴微陣列（DMA）由超疏水背景上的親水點(diǎn)組成，允許在平面表面上形成亞微升范圍內(nèi)分離且均勻的液滴。使用納升液體分配器精確填充通常尺寸為350 - 1000 ?m的DMA斑點(diǎn)。每個(gè)DMA具有672 - 6048個(gè)液滴的容量，使得在DMA平臺(tái)上能夠進(jìn)行高度微型化的高通量篩選。

圖1. 具有672個(gè)1mm大小斑點(diǎn)的液滴微陣列，每滴分配150nL。  

DMA已被用于多種化學(xué)和生物應(yīng)用，包括芯片上的高通量化學(xué)合成及隨后的生物篩選（1）、基于轉(zhuǎn)染的篩選（2）、斑馬魚(yú)胚胎篩選（3）、細(xì)菌篩選（4）和基于細(xì)胞的化合物篩選。細(xì)胞篩選可以使用任何細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行，例如細(xì)胞系、干細(xì)胞或原代細(xì)胞，在貼壁或懸浮培養(yǎng)中，使用基于球體的細(xì)胞培養(yǎng)模型進(jìn)行2D或3D培養(yǎng)。使用懸滴技術(shù)在含有150個(gè)細(xì)胞的100nL液滴中，在24 - 48小時(shí)內(nèi)已證明在不同的腫瘤細(xì)胞系中形成單個(gè)球體（6）。  

【VitroGel 水凝膠平臺(tái)】

VitroGel無(wú)外源成分（無(wú)動(dòng)物源）水凝膠系統(tǒng)是動(dòng)物源性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的Z越替代品，避免了未知成分的不確定性，為獲得一致的結(jié)果，提供了明確且具有生物學(xué)功能的微環(huán)境。該水凝膠在室溫下具有獨(dú)特的流變剪切稀化和快速恢復(fù)特性，允許高通量分配的極其順暢的過(guò)程，并為微陣列應(yīng)用提供出色的水凝膠液滴均勻性。 

本應(yīng)用筆記重點(diǎn)介紹了使用即用型、無(wú)外源成分的功能性水凝膠系統(tǒng)VitroGel 水凝膠基質(zhì)（VHM01）在DMA上生成腫瘤細(xì)胞球體。該水凝膠在室溫下穩(wěn)定，pH值中性，透明，可滲透液體/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并經(jīng)過(guò)優(yōu)化以支持多種細(xì)胞類(lèi)型。與細(xì)胞培養(yǎng)基混合后，形成柔軟可注射的水凝膠，非常適合本研究中的注射或液體分配。 

由于納升體積和斑點(diǎn)之間的差距較小，在微型DMA平臺(tái)上進(jìn)行分配對(duì)液體分配器來(lái)說(shuō)具有挑戰(zhàn)性。已經(jīng)確定了許多能夠準(zhǔn)確瞄準(zhǔn)DMA上斑點(diǎn)的非接觸式液體分配器。此外，由于水凝膠的高粘度，其分配可能具有挑戰(zhàn)性。然而，由于其獨(dú)特的流變特性，VitroGel可以在室溫或37°C下保持長(zhǎng)期（數(shù)小時(shí)）可注射狀態(tài)，而不會(huì)堵塞分配器的源孔。將150nL的VitroGel -細(xì)胞混合物分配到具有672個(gè)斑點(diǎn)的DMA上大約需要一分鐘，并產(chǎn)生非常均勻的模式。人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和人黑色素瘤細(xì)胞系SK - MEL - 28在培養(yǎng)72小時(shí)后，在每個(gè)DMA液滴的VitroGel基質(zhì)中形成許多存活的圓形球體（圖2和圖3）。  

圖2. 通過(guò)在DMA上分配與細(xì)胞混合的VitroGel生成HeLa球體。如材料和方法中所述，72小時(shí)后進(jìn)行針對(duì)波形蛋白（綠色）和KI67（紅色）的免疫熒光染色。細(xì)胞核用Hoechst染色。上圖：一個(gè)斑點(diǎn)的描述。下圖：其放大圖。

圖3. 通過(guò)在DMA上分配與細(xì)胞混合的VitroGel生成SK - MEL 28球體。如材料和方法中所述，72小時(shí)后進(jìn)行針對(duì)波形蛋白（綠色）和KI67（紅色）的免疫熒光染色。細(xì)胞核用Hoechst染色。 

【結(jié)論】

總之，成功地使用即用型、無(wú)外源成分的功能性水凝膠系統(tǒng)VitroGel水凝膠基質(zhì)（VHM01）在DMA上生成了腫瘤細(xì)胞球體。形成了兩種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞球體。通過(guò)免疫熒光染色進(jìn)行了可視化。通過(guò)在DMA上分配與細(xì)胞混合的VitroGel生成HeLa球體。如材料和方法中所述，72小時(shí)后進(jìn)行針對(duì)波形蛋白（綠色）和KI67（紅色）的免疫熒光染色。細(xì)胞核用Hoechst染色。通過(guò)在DMA上分配與細(xì)胞混合的VitroGel生成SK - MEL 28球體。如材料和方法中所述，72小時(shí)后進(jìn)行針對(duì)波形蛋白（綠色）和KI67（紅色）的免疫熒光染色。細(xì)胞核用Hoechst染色。  

【材料和方法】

細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa和SK - MEL 28細(xì)胞在含有10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到80 - 90％合流時(shí)進(jìn)行傳代。

3D培養(yǎng)

對(duì)于HeLa和SK - MEL 28細(xì)胞的3D培養(yǎng)，使用了VitroGel水凝膠基質(zhì)。在含有30％FBS的DMEM培養(yǎng)基中制備細(xì)胞懸液。將400uL的VitroGel溶液與200uL的細(xì)胞懸液以2：1的比例（v / v）混合，以使水凝膠 - 細(xì)胞混合物的最終FBS濃度為10％。  

【分配】

使用低體積納升分配器I - DOT Mini（AQ版）將水凝膠 - 細(xì)胞混合物分配到具有672個(gè)1mm大小斑點(diǎn)的液滴微陣列上。將400uL的水凝膠 - 細(xì)胞混合物加載到源孔中，并使用“VitroGel”液體類(lèi)別（4滴253mbar）在66秒內(nèi)進(jìn)行每點(diǎn)150nL的分配。立即將DMA轉(zhuǎn)移到含有4mL加濕緩沖液和蓋子中加濕墊的培養(yǎng)皿中。在室溫下孵育15分鐘后，將50nL含有10％FCS的DMEM分配到每個(gè)液滴上。立即將DMA轉(zhuǎn)移回加濕培養(yǎng)皿中，并在37°C和5％CO2下孵育。  

【在液滴微陣列（DMA）上進(jìn)行KI67和波形蛋白的免疫熒光染色和顯微鏡觀察】

在將細(xì)胞接種到DMA上72小時(shí)后進(jìn)行染色。將DMA在適當(dāng)?shù)娜旧萜髦薪氡涞腜BS中洗滌三次。在染色容器中，用4％福爾馬林在室溫下固定細(xì)胞，然后用TBS（3X）洗滌。然后將DMA在含有0.1％Triton X - 100的TBS（9.9ml TBS + 100uL Triton X - 100）中在染色罐中孵育15分鐘，然后進(jìn)行三次洗滌步驟。為了減少非特異性結(jié)合，將DMA直接在DMA上與Power Block（在dd H2O中1：10稀釋?zhuān)┮黄鸱跤⑹褂檬災(zāi)ば⌒牡胤植荚谡麄€(gè)DMA上。用真空除去任何剩余的液體。 最后，將150nL的一抗混合物（在最大75bar下）分配到DMA的每個(gè)斑點(diǎn)上，并在濕潤(rùn)室中在4°C下孵育過(guò)夜（KI67多克隆抗體：Life Technologies目錄＃PA519462，在PBS中1：50稀釋?zhuān)徊ㄐ蔚鞍讍慰寺】贵w（J144）：Invitrogen目錄＃MA3 - 745，在PBS中1：50稀釋?zhuān)Ｔ谟肨BS - Tween進(jìn)行三次額外洗滌步驟后，將150nL的二抗混合物（山羊抗兔IgG，DyLightTM594：ThermoScientific＃UJ291725，1：250和山羊抗小鼠IgG（H＆L），DyLightTM 488：ThermoScientific＃UJ291725，1：250）和核標(biāo)記物Hoechst（Hoechst 33343：ThermoScientific，＃62248）分配到每個(gè)斑點(diǎn)上，并在DMA上孵育1小時(shí)。在TBS中進(jìn)行三次洗滌后，用Mowiol將細(xì)胞包埋。使用Keyence BZ - 9000顯微鏡（Keyence，大阪，日本），用2X和10X物鏡拍攝明場(chǎng)和熒光顯微鏡圖像。  

【參考文獻(xiàn)】

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