對于任何一種特定的靶抗原，都有不止一種有效抗體。為了縮小選擇范圍，實(shí)驗(yàn)中通常要考慮以下幾個方面：

1.分析或者應(yīng)用類型

2.樣品的性質(zhì)

3.樣品的種類

4.抗體宿主的種類

5.抗體的標(biāo)記和檢測

用途

抗體數(shù)據(jù)表所顯示的用途都是已經(jīng)得到檢測證明可以發(fā)揮作用的。如果某項用途沒有列出，并不意味著抗體不合適，而是還沒有檢測是否有該項用途或不知道抗體如何發(fā)揮作用。如果已經(jīng)檢測并證明無效也會在表中列出。

樣品的性質(zhì)

樣品的性質(zhì)會告訴您哪個抗體最合適，至少要考慮以下兩個方面：

1.要檢測的蛋白區(qū)域。刺激宿主動物產(chǎn)生抗體的具有免疫原性的物質(zhì)種類繁多，包括全長的蛋白、蛋白片段、多肽、整個生物機(jī)體（例如細(xì)菌）或細(xì)胞。免疫原通常在數(shù)據(jù)表中會有顯示（盡管在很多例子中由于專利原因找不到關(guān)于免疫原的詳細(xì)描述）。如果要檢測的是一個蛋白片段或全長蛋白的異構(gòu)體或特定區(qū)域，那就要求選擇的抗體是由該特異片段或區(qū)域或者包含該特異片段或區(qū)域的免疫原刺激產(chǎn)生的。如果要通過 FACS 去檢測活細(xì)胞表面蛋白，則要求選擇的抗體是由蛋白的細(xì)胞外區(qū)域刺激產(chǎn)生的。

2.樣品的處理工藝。有些抗體要求樣品先進(jìn)行特殊處理。例如，許多抗體只識別降解或變性蛋白，可能因?yàn)檫@樣會暴露藏在二次或三次折疊后蛋白內(nèi)部的抗原表位。另一方面，有些抗體僅識別自然折疊狀態(tài)蛋白上的表位。（Abcam 公司用于 western blotting 的抗體，樣品都需進(jìn)行降解和變性處理，除非在數(shù)據(jù)表中特殊標(biāo)明）。當(dāng)搜尋用于免疫組化的抗體時，則應(yīng)注意有些抗體只適合用于未固定冷凍組織。有時，抗原修復(fù)步驟則必不可少，這樣可以消除由福爾馬林固定所引起交聯(lián)，因?yàn)橛行┛贵w不能結(jié)合福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的靶目標(biāo)。在數(shù)據(jù)表的應(yīng)用章節(jié)會明確指出上述限制。

樣品種類

盡管由于具有足夠多的同源氨基酸序列，抗體可以和其它物種的同一靶蛋白反應(yīng)，但是我們選擇的抗體仍然應(yīng)該是來源于同一物種的抗原刺激產(chǎn)生的。如果樣品不是來自于列表所示的物種之一，也不能說明該抗體不可以用來檢測這種樣品，而可能是來自該物種的樣品沒被檢測過，因此我們很難推薦它的適用性。根據(jù)序列相似性可以預(yù)測交叉反應(yīng)性：值得驕傲的是在數(shù)據(jù)列表里有 ExPASy 和 NCBIBLAST 的鏈接，可以比對不同物種來源氨基酸序列的同源性。

選擇一抗宿主的類別

一般來說，當(dāng)用標(biāo)記二抗來檢測非標(biāo)記一抗時，產(chǎn)生一抗的宿主動物的類別就非常重要。對于免疫組化，產(chǎn)生一抗的宿主應(yīng)盡可能的和樣品的宿主種類不同，以避免二抗的免疫球蛋白與樣品中內(nèi)在的免疫球蛋白發(fā)生潛在的交叉反應(yīng)。例如，用于檢測鼠源蛋白的一抗就不 應(yīng)來源于鼠或大鼠，來源于兔則是比較適合的選擇，接下來用檢測分子（酶、熒光、生物素等）標(biāo)記的抗兔 IgG 的二抗進(jìn)行結(jié)合。如果有已標(biāo)記的一抗則可以直接避免上述交叉反應(yīng)發(fā)生。對于不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣品的檢測，宿主的種類選擇不用很嚴(yán)格。例如進(jìn)行western blotting 的細(xì)胞裂解液就被認(rèn)為不包含 IgG。而組織溶解液和組織培養(yǎng)上清（包括血清）則被認(rèn)為是含免疫球蛋白的。Westernblotting 時 IgG 會以 50 和 25kDa 的條帶出現(xiàn)在降解和變性樣品中，分別相當(dāng)于 IgG 分子的重鏈和輕鏈。

選擇二抗

二抗應(yīng)來源于抗一抗的物種。舉例來說，如果您的一抗來源于鼠，那么二抗就應(yīng)該選擇抗鼠的。我們建議仔細(xì)核對二抗數(shù)據(jù)表以確定您要使用的二抗。

Abcam提供有大量標(biāo)記各種熒光物質(zhì)和染色物質(zhì)的二抗。檢查您所用的一抗數(shù)據(jù)表的底部，將會顯示一些合適的二抗。為了找到您自己的二抗，可以使用我們的導(dǎo)航框或通過主頁中心的鏈接來選擇產(chǎn)品類型，然后選擇您一抗的種類，這樣會顯示大量適用于一抗種類的二抗。

雙重染色抗體的選擇

對細(xì)胞培養(yǎng)液或組織上清液進(jìn)行雙免疫染色要求非標(biāo)記一抗來源于不同物種的動物，而二抗則特異性識別其中一種一抗。二抗如果與其他動物來源的免疫球蛋白有交叉吸附，則會在數(shù)據(jù)表中明確說明。

熒光和染料標(biāo)簽

標(biāo)簽結(jié)合在抗體上使抗體的結(jié)合可見。標(biāo)簽的選擇依據(jù)以下幾個方面

1.檢測方法：熒光或有色沉淀。熒光標(biāo)簽會在特定波長的光激發(fā)下發(fā)光。根據(jù)它們自己激發(fā)和發(fā)光性質(zhì)不同，有一些熒光標(biāo)簽是可用的。在結(jié)合了合適的底物時，酶標(biāo)簽HRP和AP可以形成有色沉淀。

2.有效的封固劑（只限免疫組化）：AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色劑均溶于酒精，因此要求使用水溶性封固劑。以上提到的其他有機(jī)物要想得到較好的折射率，最好使用有機(jī)封固劑封固。熒光素標(biāo)簽需要水溶性封固劑。膽藻素蛋白（藻青蛋白/藻紅蛋白）需要不加甘油的水溶性封固劑，否則會產(chǎn)生淬滅效應(yīng)。

3.生物素標(biāo)記的抗體對于信號的放大是很有效的，比如可應(yīng)用于親和素-生物素-酶或熒光復(fù)合物（通常縮寫為ABC試劑）或者親和素或鏈

霉親和素結(jié)合酶或熒光染料檢測法。

未純化抗體的建議稀釋和濃縮

未純化抗體在某一特定抗體濃度下會發(fā)生很顯著的變化。如果不清楚給定的未純化抗體樣品的濃度，就可以參考下面的“特殊范圍”作為估計的指導(dǎo)。