一、直接ELISA操作步驟

常規(guī)程序

包被抗原

1.用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀釋抗原到 PVC 微孔板上，按要求往后進行系列稀釋。

(樣品純度較高時通常在酶標板上稀釋到不少于 2μg/ml。

不一定用純化的溶液，不過，一般在試驗樣品中目的蛋白（抗原）含量需大于 3%。

抗原的蛋白濃度在酶標板上應該不高于 20μg/ml，此時已經足夠中和酶標板上的位點了。

確保抗原的濃度在抗體可以檢測到的范圍內。)

2.在酶標板上覆蓋封口膜，室溫孵育 2 小時，或者 4°C 過夜。包被的孵育時間需要優(yōu)化。

3.倒掉孵育溶液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。

封閉

4.用 200μl 含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的PBS緩沖液封閉酶標板上剩余的蛋白結合位點。或者用其他封閉劑如 BlockACE、BSA（牛血清蛋 白）代替。

5.用封口膜覆蓋酶標板室溫至少孵育 2 小時，或者 4°C 過夜。

6.用 PBS 洗板 2 次。

加抗體孵育

7.加入 100 μl 抗體，稀釋到最佳濃度（參照說明書），使用前用封閉液現配。

8.用封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 2 小時，該孵育時間需要進行優(yōu)化。盡管 2 小時的孵育通常可以獲得足夠強的信號，但如果獲得的信號較弱 時，通過 4°C 孵育過夜通常可以獲得較強信號。

9.用 PBS 洗板 4 次。

檢測

10.用多通道吸液器向每孔加入 100μl（或 50μl）底物。

11.顯示出足夠深的顏色之后，再向每孔加終止液 100μl（如果必須）。

12.用酶標儀讀每個孔的吸光度值（光密度）。

注意：一些酶作用物是有害的(致癌物)，因此必須小心操作并佩戴手套。

數據分析

根據連續(xù)稀釋的數據制作一條標準曲線，x 軸為濃度（對數轉換），y 軸為吸光度值（線性）。將樣品吸光度值代入標準曲線求出濃度。

二、夾心 ELISA

夾心 ELISA 用兩種抗體協(xié)同測定抗原的含量（例如：捕獲抗體和檢測抗體）。抗原必須包含至少 2 個能被抗體識別的抗原位點才能被檢測 ，因為至少有 2 個抗體參與到這個試驗中。

在夾心 ELISA 中，單克隆抗體和多克隆抗體都可以被用作捕獲和檢測抗體。單抗識別單一的抗原表位，可以區(qū)別抗原的微小差別使抗原得到 更精確地檢測和定量。多克隆抗體通常被用作捕獲抗體,以捕獲盡可能多的抗原。

夾心 ELISA 的優(yōu)勢是樣品在分析前不需要純化, 檢測靈敏度高（靈敏度是直接法或間接法的 2-5 倍）。

注意事項：

夾心 ELISA 的步驟很難優(yōu)化，試驗中應使用測試過的配對抗體。這樣可以確保在不干擾其他抗體結合的情況下，檢測目標蛋白上相應的不同 抗原表位。因此對于沒有做過特定測試試驗的抗體，我們不能確保我們的抗體可以用于夾心 ELISA。請參閱抗體說明書有關抗體測定應用的信息。

常規(guī)步驟：

包被捕獲抗體

1.用碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液 (pH7.4) 稀釋捕獲抗體至濃度 1-10μg/ml，包被酶標板。

如果使用了沒有純化的抗體（例如:腹水或抗血清），可能需要通過提高樣品蛋白濃度（試一下 10μg/ml），來補償特定抗體數量較低的問題。

2.用封口膜覆蓋酶標板,于 4°C 孵育過夜。

3.倒掉包被液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。

封閉和加樣品

4.封閉包被后孔內殘留的蛋白結合位點,每孔加 200μl，含 5% 脫脂奶粉的 PBS 封閉液。

5.用封口膜覆蓋酶標板，室溫孵育至少 1-2 小時或者如果方便的話，4°C 孵育過夜。

6.每孔加 100μl 適當稀釋的樣品。在精確定量測定時，通常將未知濃度樣品與陽性對照標準曲線相比較，每塊板都要帶標準（做平行或者三 份）和空白對照以保證精確性。37°C 孵育 90 分鐘。

(對于定量檢測，標準品的使用濃度應覆蓋抗體結合的大部分動態(tài)檢測范圍。您可能需要優(yōu)化標準品的濃度使用范圍，

以確保得到一個合適的標準曲線。為了精確定量，樣品和標準通常做 2 份或 3 份。)

7.倒掉樣品,每孔用 200μl PBS 洗板 2 次。

用檢測抗體和二抗先后進行孵育

8.每孔加入 100μl 稀釋好的檢測抗體

(確保檢測抗體與包被抗體識別目標蛋白上不同的抗原表位，這防止了抗體結合的沖突，

保證第二個抗體結合位點可以用來結合，盡可能的使用測試過相匹配的配對抗體。)

9.用封口膜覆蓋酶標板，室溫孵育 2 小時。

10.用 PBS 洗板 4 次。

11.加入 100μl 標記二抗，使用前用封閉液快速稀釋至最佳濃度（根據說明書）。

12.用封口膜覆蓋酶標板,室溫孵育 1-2 小時。

13.用 PBS 洗板 4 次

檢測

雖然許多種類的酶都可以用來檢測，但辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 實驗中是被廣泛應用的兩種酶。我們必須要考慮 到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性（例如肺泡細胞中高含量的AP,紅血球中高含量的過氧化物酶），這可能導致不精確的結果。如 果有必要的話，用左旋咪唑（針對 AP）或含 0.3% 雙氧水溶液的甲醇（針對過氧化物酶）進行一個附加的封閉處理。

AP 底物

pNPP（對硝基苯基磷酸鹽）是最廣泛使用的底物。室溫下孵育 15-30 分鐘后，硝基酚的黃顏色可以在 405nm 下被檢測出（這一

反應可以通 過加入適當量的 0.75M 氫氧化鈉溶液來終止）。

HRP 顯色劑

HRP 的底物是過氧化氫，反應中，過氧化氫分解使氫供體氧化產生顏色變化。

TMB (3,3’,5,5’-四甲基對二氨基聯苯)加 TMB 溶液至每孔，孵育 15-30 分鐘，加適量終止液（2M 硫酸），在 450nm 下讀取吸光度值。

OPD (鄰苯二胺鹽酸鹽)終產物在492nm下檢測。需要注意的是這種底物對光敏感，因此需要避光保存。

ABTS (2,2’-連氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氫二銨鹽)終產物是綠色的，在 416nm 測定吸光度值。

(注意：一些酶作用物是有害的(致癌物)，因此必須小心操作并佩戴手套。)

14.使用多通道移液器每孔加入底物溶液 100μl（或 50μl）。

數據分析： 根據連續(xù)稀釋的數據制作一條標準曲線，x 軸為濃度(對數轉換)，y軸為吸光度值(線性)。將樣品吸光度值代入標準曲線

求出濃度。