在過去的十多年中，短讀長RNA測序（RNA-seq）已被廣泛用于轉(zhuǎn)錄組分析。但由于其讀長較短，因此短讀長RNA測序在解析全長轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體和復(fù)雜RNA加工事件的能力上受到很大限制。相比之下，長讀長測序技術(shù)可以生成長度超過10kb的序列，從而直接對全長轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序。但長讀長測序的通量相對較低，這也成為限制其在轉(zhuǎn)錄組分析領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一大瓶頸。

費(fèi)城兒童醫(yī)院的研究人員近日開發(fā)出一種多功能且低成本的全長RNA分子靶向測序技術(shù)，有望加速新的診斷和治療方法的發(fā)現(xiàn)。與商業(yè)化的靶向RNA測序解決方案相比，這項(xiàng)名為TEQUILA-seq的技術(shù)具有很高的成本效益，適用于不同的研究和臨床用途。

這篇題為“TEQUILA-seq: a versatile and low-cost method for targeted long-read RNA sequencing”的論文于8月8日發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。

在翻譯成蛋白質(zhì)之前，RNA分子可能會(huì)以不同的方式切割和連接。這個(gè)過程被稱為選擇性剪接，它允許一個(gè)基因編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。

盡管選擇性剪接發(fā)生在許多生物過程中，但它在癌癥等疾病過程中可能失調(diào)，帶來致病性的RNA分子。為了了解選擇性剪接如何導(dǎo)致疾病，研究人員需要對單個(gè)基因產(chǎn)生的所有RNA分子（又稱為轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體）進(jìn)行準(zhǔn)確的記錄。

長讀長RNA測序平臺可以實(shí)現(xiàn)這種分析。它對長度超過10,000個(gè)堿基的RNA分子進(jìn)行端到端測序，捕獲整個(gè)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。然而，這些長讀長平臺的測序產(chǎn)量不高，這阻礙了它們的廣泛采用，特別是在臨床環(huán)境中。靶向測序是在測序之前富集感興趣的特定核酸序列，可以大大提高目標(biāo)的測序深度。

共同通訊作者、費(fèi)城兒童醫(yī)院雷蒙德-佩雷爾曼細(xì)胞與分子治療中心的Lan Lin博士稱：“長讀長RNA靶向測序是一種強(qiáng)大的策略，可以闡明任何一組預(yù)定義基因的RNA庫。然而，現(xiàn)有的全長RNA分子靶向測序技術(shù)要么昂貴，要么難以建立，這使得許多實(shí)驗(yàn)室望塵莫及。”

“TEQUILA-seq解決了這個(gè)問題，因?yàn)樗鼉r(jià)格低廉，簡單易用。用戶可以根據(jù)不同的目的調(diào)整這項(xiàng)技術(shù)，研究人員可以選擇他們想要測序的基因，并在自己的實(shí)驗(yàn)室中制備靶向捕獲所需的試劑。這有望幫助人們開發(fā)各種疾病的新型診療方案。”

在靶向富集時(shí)，人們通常采用雜交捕獲方法。這種方法以寡核苷酸片段作為捕獲探針，從生物樣本中捕獲和分離其目標(biāo)序列。然而，盡管雜交捕獲是一種有效的靶向測序方法，但商業(yè)合成的生物素化捕獲探針價(jià)格貴，只能用于有限數(shù)量的反應(yīng)，這使得每個(gè)捕獲反應(yīng)的單個(gè)樣品成本很高。

為了克服這一限制，費(fèi)城兒童醫(yī)院的研究人員開發(fā)出TEQUILA-seq（利用等溫線性擴(kuò)增探針和長讀長測序的轉(zhuǎn)錄本富集和定量)。TEQUILA-seq的關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)之一是采用了一種由核酸內(nèi)切酶觸發(fā)的等溫鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，它能夠以非生物素化的寡核苷酸作為模板來合成大量的生物素化捕獲探針。

僅僅使用2 ng的模板寡核苷酸，研究人員就可以生成高達(dá)25 ug的TEQUILA探針，用于至少250個(gè)捕獲反應(yīng)。這種合成捕獲探針的創(chuàng)新策略使得TEQUILA-seq具有很高的成本效益，并具有可擴(kuò)展性，適用于大型的分析組合和大量的生物樣品。

為了對其性能進(jìn)行基準(zhǔn)測試，研究人員在多個(gè)基因組合上對合成RNA或人類RNA進(jìn)行了TEQUILA-seq分析。TEQUILA探針在目標(biāo)捕獲和富集方面的表現(xiàn)與商業(yè)捕獲探針一樣好，而每次捕獲反應(yīng)的成本卻低數(shù)百倍。此外，研究人員還證明，TEQUILA-seq可以在定量目標(biāo)RNA分子的同時(shí)大大提高檢測能力。

共同通訊作者、費(fèi)城兒童醫(yī)院計(jì)算與基因組醫(yī)學(xué)中心主任Yi Xing博士表示：“TEQUILA-seq使用便宜的試劑和簡單的實(shí)驗(yàn)流程，就能夠?qū)υS多生物樣品中的全長RNA分子進(jìn)行深度測序。這非常令人興奮，它讓廣泛的醫(yī)學(xué)應(yīng)用成為可能，從RNA引導(dǎo)的基因診斷到療法開發(fā)。”

為了展示這項(xiàng)技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)用途，研究人員采用TEQUILA-seq分析了40個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中468個(gè)癌基因的全長RNA分子。他們在廣泛研究的癌基因中發(fā)現(xiàn)了以前未知的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，這也許會(huì)揭示保護(hù)機(jī)體免受癌癥侵襲的基因是如何失活的。

“我們的工作表明，TEQUILA-seq可以廣泛應(yīng)用于全長RNA分子的靶向測序，”Lin博士說。“此外，TEQUILA探針是通用型捕獲探針。它們可以與長讀長和短讀長測序平臺上的靶向RNA和DNA測序兼容。以低成本輕松生成大量生物素化捕獲探針的能力有助于許多基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用中的大規(guī)模和群體水平研究。”

原文檢索：

Wang, F., Xu, Y., Wang, R. et al. TEQUILA-seq: a versatile and low-cost method for targeted long-read RNA sequencing. Nat Commun 14, 4760 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40083-6