分子生物學(xué)研究中質(zhì)粒構(gòu)建是最常用的實驗技術(shù)。原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA 連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體 DNA 進行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細胞，實現(xiàn)目的基因在宿主細胞內(nèi)的正確表達。

同源重組的基因克隆方法， 相比雙酶切載體構(gòu)建方法，該方法的構(gòu)建過程有些不同，雙酶切構(gòu)建過程比較繁瑣，同源重組構(gòu)建過程相對簡單，可以省去很多的時間和精力，但假陽性率略高。

同源重組法構(gòu)建載體

首先，靶基因片段擴增引物有別于常規(guī)引物設(shè)計；

其次，載體切割過程中只需要進行單酶切；

第三，載體和目的基因片段的連接是基于同源重組而不是粘性末端互補。

采用同源重組法構(gòu)建載體與常規(guī)雙酶切構(gòu)建載體方法不同。

首先，設(shè)計引物時上游引物5’端前面加的是酶切位點（如Hind III）及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應(yīng)前面的15個堿基載體片段，下游引物5’端前面加的是Hind III酶切位點及該酶切位點在pMIR reporter載體中對應(yīng)后面的15個堿基載體片段，如此設(shè)計引物是為了保證目的片段插入載體時方向正確。

其次，載體只需要單酶切，用Hind III酶切pMIR reporter，使得pMIR reporter成為兩端都帶著Hind III位點的線性載體。相比雙酶切切割載體，單酶切可以保證酶切后的載體都是單一的線性片段，使得后續(xù)的重組連接更準(zhǔn)確。

第三，省去了TA克隆環(huán)節(jié)。因為PCR產(chǎn)物可以直接用于重組連接，不需要酶切產(chǎn)生粘性末端，而且重組酶的重組能力強于T4 DNA連接酶的連接能力，一般只需要一步即可重組連接成功，因此可以在重組反應(yīng)之后進行測序鑒定。

詳解：

基于同源基因重組原理，適用于向幾乎任何載體在任何位點進行定向克隆，無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點可高效克隆 50 bp～10 kb 片段，同時構(gòu)建時間也大大縮短。

1. 載體的制備一般推薦雙酶切線性化，線性化完全，假陽性克隆低。酶切體系同上。

2. 對于使用重組方式連接來說，PCR 要設(shè)計引物, 設(shè)計引物時要根據(jù)質(zhì)粒載體和基因序列選擇合適的同源序列，通過 PCR 擴增方式進行連接，PCR 的產(chǎn)物要純化。

引物設(shè)計原則簡單總結(jié)一下：

（1）前向引物：5’ 端--上游克隆載體末端同源序列+基因正向擴增引物--3’ 端

（2）反向引物：3’ 端--基因反向擴增引物+下游克隆載體末端同源序列--5’ 端

如果設(shè)計的基因特異插入片段擴增產(chǎn)物長度較長，可以選擇 PCR 方式進行目的引物的擴增。

[可選 PCR 擴增體系]

ddH2O                       14 ul

10 x Taq buffer           2 ul

10 um DNTP              1 ul

10 um primer F          0.5 ul

10 um primer R          0.5 ul

Vector                        1 ul

Taq 酶                        1 ul

[可選 PCR 擴增條件]

(1)95℃：5min

(2) 35cycle

95℃：30s

55℃：30s（退火溫度可以根據(jù)目的引物TM值決定，一般退火溫度根 據(jù)引物TM值降低5度）

72℃：40s

(3)72℃：10min

(4)16℃：hold

PCR 擴增后，通過膠回收方式獲得純化的 PCR 產(chǎn)物。純化后的 PCR 產(chǎn)物不需要進行酶切，直接用于重組反應(yīng)。

3. 目的引物與線性載體進行重組反應(yīng)。

[可選重組體系]

5 × CE II Buffer           4 μl

線性化克隆載體          50～200 ng

插入片段擴增產(chǎn)物      20～200 ng

ExnaseII                  2 μl

ddH2O                        x ul

在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，置于 37 ℃ 反應(yīng) 30 min。待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻 5 min。重組效率在反應(yīng) 30 min 左右達到最高，反應(yīng)時間不足或者太長都將會降低克隆效率，這樣大大減少了連接時間。

4. 轉(zhuǎn)化

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中（一般為 DH5a），涂板，培養(yǎng)過夜。

5. 挑取單克隆，并鑒定

挑去平板上的單克隆培養(yǎng)，可以通過 PCR 或者酶切初步鑒定陽性克隆，對初步鑒定出來的陽性克隆進行測序。

最后，幾個主要注意事項：

1. 載體克隆位點選擇盡量選擇無重復(fù)序列，且 GC 含量比較均勻的區(qū)域進行克隆。當(dāng)克隆位點上下游 20 bp 區(qū)域內(nèi) GC 含量均在 40%～60% 范圍之內(nèi)時， 克隆效率將達到最大.

2. 最適克隆載體與插入片段摩爾比為 1:2，即最適插入片段使用量為 0.06 pmol。這些摩爾數(shù)對應(yīng)的 DNA 質(zhì)量可由以下公式粗略計算獲得：

最適克隆載體使用量 = [0.02 × 克隆載體堿基對數(shù)] ng（0.03 pmol）

最適插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段堿基對數(shù)] ng（0.06 pmol）

3. 雙酶切 1 和 2，在設(shè)置酶切體系時要考慮酶切溫度以及 Activity in NEBbuffer 的問題。