Western印跡可重點(diǎn)概括為三個(gè)步驟：1、在聚丙烯酰胺凝膠上分辨一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品；2、將分辨好的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上；3、膜上特定蛋白質(zhì)的鑒定。下面將重點(diǎn)為大家介紹了SDS-PAGE技術(shù)的操作要點(diǎn)和考慮因素。

Western印跡是否成功則必須滿足四個(gè)要求：

1、從凝膠上洗脫 – 在轉(zhuǎn)移過(guò)程中蛋白質(zhì)必須從凝膠上洗脫。如果它仍保留在凝膠上，則無(wú)法開(kāi)展印跡分析。

2、吸附到膜上 – 在轉(zhuǎn)移過(guò)程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上。如果蛋白質(zhì)不吸附，則無(wú)法開(kāi)展印跡分析。

3、處理過(guò)程中的蛋白截留 – 在轉(zhuǎn)移后的印跡處理過(guò)程中，蛋白質(zhì)必須仍然吸附在膜上。

1、處理過(guò)程中蛋白的可及性 – 吸附的蛋白質(zhì)必須能與檢測(cè)它的化學(xué)試劑接觸。如果蛋白質(zhì)被掩蔽，那它就無(wú)法被檢測(cè)。

Western印跡中所涉及操作的理論和實(shí)際考慮。

在1-D或2-D凝膠上分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。在印跡之前分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的最常用方法是一維（1-D）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），其中蛋白質(zhì)是根據(jù)其分子量分離的（圖1）。在某些情況下，使用非變性條件來(lái)分離天然蛋白。盡管這種方法通常不及變性電泳的分辨率，但是在一抗只識(shí)別非變性蛋白或必須在膜上保留蛋白質(zhì)的生物活性時(shí)，這特別有用。

二維（2-D）凝膠電泳是分析細(xì)胞類型、組織和體液中蛋白質(zhì)組成的理想技術(shù)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)。2-D凝膠的免疫印跡提供了分子量和等電點(diǎn)的信息，在區(qū)分翻譯后修飾所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)異構(gòu)體上很有用（Celis和Gromov，2000）。在某些情況下，通過(guò)等電聚焦的一維分離后的免疫印跡可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分型（Poland等，2002；Eto等，1990）。二維印跡的例子如圖2所示。

分子量標(biāo)準(zhǔn)品

凝膠中包含分子量（MW）標(biāo)準(zhǔn)品，或marker，有助于在電泳分離后估計(jì)感興趣的蛋白質(zhì)的大小。目前有兩種類型的標(biāo)準(zhǔn)品，未染和預(yù)染。未染的MW marker通常包含已純化的分子量已知的天然或重組蛋白。觀察它們?cè)谀z或膜上的定位需要借助一個(gè)染色步驟。

預(yù)染的MW marker如圖4所示。使用預(yù)染marker既有優(yōu)點(diǎn)，也有缺點(diǎn)。預(yù)染marker可實(shí)現(xiàn)在電泳過(guò)程中監(jiān)控凝膠上的蛋白質(zhì)分離。它們也能指示后續(xù)轉(zhuǎn)印步驟中的轉(zhuǎn)移效率。然而，它們相對(duì)較貴，且染料的添加可能影響蛋白質(zhì)遷移率。在確定分子量時(shí)，預(yù)染marker沒(méi)那么準(zhǔn)確，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)上結(jié)合的染料會(huì)改變印跡過(guò)程中它們吸附到膜上的能力。

圖1. 實(shí)現(xiàn)了電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)遷移的直接觀察以及任一Western印跡上準(zhǔn)確的大小判定。

圖2. 通過(guò)二維電泳分離的蛋白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。大鼠成纖維細(xì)胞系的銀染2-D凝膠（左）和同一張凝膠的印跡（右），在轉(zhuǎn)印P膜上用小鼠單克隆抗體雜交，并通過(guò)化學(xué)發(fā)光法觀察。

聚丙烯酰胺的濃度

凝膠上聚丙烯酰胺的濃度可以是均勻的，也可以是梯度的。最常用的聚丙烯酰胺濃度，10%，最適合10-150 kDa范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分離。如果正在分析未知的蛋白質(zhì)，或需要更廣泛的分離，建議使用梯度膠。例如，4-12%的Tris甘氨酸凝膠適合30至200 kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，而10-20%的凝膠能成功分離6至150 kDa的蛋白質(zhì)。SDS-PAGE凝膠的厚度通常為1.0和1.5 mm；不過(guò)，對(duì)于印跡而言，較薄凝膠（= 1 mm）的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移最好。

凝膠電泳緩沖液

最常用的凝膠電泳緩沖液是由Tris甘氨酸或Tris-tricine組成的。緩沖液中可能含有0.1%的去污劑，通常是SDS。Tris甘氨酸緩沖液系統(tǒng)適合分離分子量范圍廣（6-200 kDa）的蛋白質(zhì)，并與變性或非變性條件兼容。Tris-tricine系統(tǒng)最適合分離較小的，需要在上樣之前還原和變性的蛋白質(zhì)（<10 kDa）。兩種緩沖液系統(tǒng)都與蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上兼容。Tris醋酸緩沖液有時(shí)用于較大蛋白的分離。

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