真核細(xì)胞依賴于多種途徑的膜循環(huán)，比如溶質(zhì)分泌、營養(yǎng)吸收或膜蛋白周轉(zhuǎn)。每個途徑都使用幾種類型的細(xì)胞器，從質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體到回收中間體，如載體或運(yùn)輸囊泡。如何確定在給定途徑中起作用的不同細(xì)胞器和回收中間體的類別是一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)。并且不同細(xì)胞器的循環(huán)膜和蛋白質(zhì)標(biāo)記物也需要同時識別。

為了解決上述問題，通常的做法是采用熒光團(tuán)標(biāo)記回收細(xì)胞器的膜并使用免疫染色技術(shù)來揭示同一細(xì)胞器上的蛋白質(zhì)標(biāo)記。但是由于探針容易從它們的目標(biāo)細(xì)胞器中丟失，甚至可能被困在其他結(jié)構(gòu)中，例如線粒體。同時，由于大量的轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞器彼此非常接近，這使得傳統(tǒng)的衍射顯微鏡難以區(qū)分它們。

為了克服這些限制，一種新型膜探針被開發(fā)出來，稱為膜結(jié)合熒光團(tuán)-半胱氨酸-賴氨酸-棕櫚酰基團(tuán)membrane-binding fluorophore-cysteine-lysine-palmitoyl group (mCLING)，這種新型mCLING探針，由一個八肽組成，包括一個半胱氨酸和七個賴氨酸，其中一個與棕櫚酰尾相連，它的分子量為 2,056D，包括 Atto647N部分。馬來酰亞胺基團(tuán)將半胱氨酸橋接到熒光團(tuán)。

mCLING探針能標(biāo)記質(zhì)膜并在內(nèi)吞過程中被吸收。它在固定和透化后仍然附著在膜上，因此可以與免疫染色和超分辨率顯微鏡結(jié)合使用。 mCLING已經(jīng)得到驗(yàn)證的應(yīng)用包括哺乳動物培養(yǎng)的細(xì)胞、酵母、細(xì)菌、原代培養(yǎng)的神經(jīng)元、黑腹果蠅幼蟲神經(jīng)肌肉接頭和哺乳動物組織。mCLING使我們能夠研究不同運(yùn)輸細(xì)胞器的分子組成。

mCLING的標(biāo)記模式與活細(xì)胞中 FM染料的標(biāo)記模式相同，證實(shí)該探針確實(shí)報告了內(nèi)吞作用。此外，mCLING對細(xì)胞沒有毒性作用。

在 mCLING存在下，我們將這些配體應(yīng)用于培養(yǎng)中的COS7細(xì)胞。實(shí)時熒光成像顯示幾乎所有含有配體的細(xì)胞器均被 mCLING 標(biāo)記。重要的是，mCLING的存在不會干擾COS7細(xì)胞中的膜運(yùn)輸。例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白攝取量不受mCLING的影響；它的回收和釋放也不受影響。

如圖，mCLING揭示了海馬神經(jīng)元中主動循環(huán)和自發(fā)循環(huán)突觸小泡之間蛋白質(zhì)組成的差異。

IHC 細(xì)胞器的多色免疫染色分析

mCLING探針技術(shù)，可用于標(biāo)記質(zhì)膜并跟蹤內(nèi)吞細(xì)胞器。與大多數(shù)用于膜標(biāo)記的市售染料不同，mCLING可以輕松地與固定和免疫染色結(jié)合用于細(xì)胞培養(yǎng)和組織中。此外，據(jù)我們所知，mCLING是唯一可用于揭示微小內(nèi)吞細(xì)胞器形態(tài)和身份的熒光探針。此外，超高分辨率顯像也是mCLING探針一大優(yōu)勢。

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