前情回顧：Biotium：微生物(細(xì)菌，真菌&酵母)熒光染色及活力檢測(cè)全套工具 

產(chǎn)品描述：

Biotium的Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Bacteria Live & Dead Cells(30027)通過兩個(gè)DNA探針DMAO和EthD-III對(duì)活細(xì)菌(綠色)和死細(xì)菌(紅色)進(jìn)行雙色熒光染色。DMAO 是一種綠色熒光核酸染料，可對(duì)活細(xì)菌和死細(xì)菌進(jìn)行染色。Ethidium Homodimer III (EthD-III) 是一種紅色熒光核酸染料，可選擇性地對(duì)細(xì)胞膜受損的死細(xì)菌進(jìn)行染色。當(dāng)用 DMAO 和 EthD-III 的混合物染色時(shí)，細(xì)胞膜完整的細(xì)菌會(huì)發(fā)出綠色熒光，而細(xì)胞膜受損的細(xì)菌會(huì)發(fā)出紅色熒光。該試劑盒適用于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀。檢測(cè)原理是通用的，適用于大多數(shù)細(xì)菌類型。用于100次流式細(xì)胞檢測(cè)或1000次顯微鏡檢測(cè)。 

特征：

• 檢測(cè)同一細(xì)胞群中的活細(xì)胞和死細(xì)胞

• 簡(jiǎn)單、快速的免洗染色

• 用于熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)

產(chǎn)品推薦：

DMAO，5 mM 溶液(2 x 100 uL) 

EthD-III，2 mM 溶液(2 x 150 uL)  

1、儲(chǔ)存和處理在4℃下避光儲(chǔ)存，按推薦儲(chǔ)存條件，產(chǎn)品的穩(wěn)定期限至少為收到日期后的2年。DMAO和EthD-III染料與核酸結(jié)合。

2、光譜特性DMAO：Ex/Em：503/530nm（與DNA共存時(shí)） 乙溴化二聚體III（EthD-III）：Ex/Em：532/625nm*（與DNA共存時(shí)） *EthD-III在279nm處也有強(qiáng)烈的紫外吸收峰

3、分析方案

1）熒光顯微鏡染色方案

• 將染料儲(chǔ)備溶液加熱至室溫，并振蕩混合。

• 通過將1微升DMAO、2微升EthD-III和8微升150毫摩爾氯化鈉（參見分析注意事項(xiàng)＃2）組合，制備100倍濃度的染色溶液。振蕩以確保充分混合。 注意：根據(jù)需要，體積可以按比例調(diào)整。

• 在微離心管中，通過以10,000 x g離心5分鐘并去除上清液來收集細(xì)菌細(xì)胞。

• 可選：用150毫摩爾氯化鈉洗滌細(xì)胞一次，通過上下移液數(shù)次。

• 通過以10,000 x g離心5分鐘并去除上清液來沉淀細(xì)菌細(xì)胞。

• 在150微摩爾氯化鈉中重新懸浮細(xì)胞100微升。

• 向100微升細(xì)菌懸浮液中加入1微升染料混合物。

• 輕輕混合，并在避光條件下室溫孵育15分鐘。

• 將樣品中的5微升轉(zhuǎn)移到玻片上，涂上玻璃蓋片，并用CoverGrip Coverslip Sealant（23005）或指甲油密封。

• 通過熒光顯微鏡對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行成像。DMAO可以使用FITC濾光片組進(jìn)行成像，EthD-III可以使用Texas Red?或Cy?3濾光片組進(jìn)行成像。

2）流式細(xì)胞術(shù)染色方案

①. 按照上述熒光顯微鏡染色方案的步驟①-⑧進(jìn)行操作。 

注意：我們建議還制備僅用DMAO染色的死細(xì)胞和僅用EthD-III染色的死細(xì)胞的單染細(xì)菌樣品。 

②. 加入0.5ml流式細(xì)胞術(shù)分析中的常用緩沖液。 

③. 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測(cè)FITC通道中的DMAO，以及PE或PE-Texas Red?通道中的EthD-III。