Epigentek：P-1030和P-1032試劑盒

DNA甲基化是表觀遺傳調控的一種重要機制，它通過在DNA的胞嘧啶堿基（C）上添加甲基基團（形成5-甲基胞嘧啶，5mC）來影響基因表達。這種甲基化狀態可以通過細胞分裂傳播，是細胞記憶轉錄狀態的關鍵機制。盡管對DNA甲基化的酶促機制已有深入了解，但關于內源性信號分子如何調節DNA甲基化機制的研究仍然較少。

一氧化氮（NO）是一種內源性產生的自由基信號分子，參與多種生理過程，包括神經傳遞、免疫反應和血管穩態。然而，NO在疾病狀態下的失調，特別是在癌癥中，與多種病理狀態相關。研究表明，NO合成酶（NOS2）的表達與多種癌癥類型的不良預后、高死亡率和對化療的抵抗性相關。盡管已知NO信號在癌癥中發揮重要作用，但NO如何直接調節DNA甲基化機制仍不清楚。

為了探究NO作為DNA甲基化內源性調控因子的可能性，”Nitric oxide inhibits ten-eleven translocation DNA demethylases to regulate 5mC and 5hmC across the genome”采用了多種實驗方法，包括體外酶活性測定、電子順磁共振（EPR）光譜、密度泛函理論（DFT）計算、細胞培養實驗、小鼠異種移植模型以及基因組范圍的甲基化分析。

研究方法

1. 體外酶活性測定：研究團隊使用純化的TET2催化域與所有輔因子（2-OG、Fe(II)、抗壞血酸）、底物（合成5mC-DNA寡核苷酸）以及NO供體（如Sper/NO）進行孵育，通過MALDI-TOF-MS檢測5mC和5hmC的相對含量，以評估NO對TET2酶活性的影響。

2. EPR光譜：為了驗證NO與TET2酶中非血紅素鐵原子的結合，研究團隊進行了EPR光譜分析，觀察了NO處理后的TET2酶的特征信號變化。

3. DFT計算：為了深入理解NO與TET2酶的結合機制，研究團隊進行了DFT計算，模擬了NO與鐵原子的結合過程及其穩定性。

4. 細胞培養實驗：研究團隊選擇了四種人類癌細胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-668、PC-3和U251），這些細胞系均表達NOS2并能夠在體內合成NO。通過外源性NO供體（如DETA/NO）處理細胞，研究團隊用Epigentek的5mC（貨號P-1030）和5hmC（貨號P-1032）檢測試劑盒測定了細胞中全局5mC和5hmC的水平。

5. 小鼠異種移植模型：為了驗證NO在體內對DNA甲基化的影響，研究團隊建立了NOS2表達的MDA-MB-231細胞系來源的小鼠異種移植模型，并通過氨基胍（AG）抑制NO合成，比較了NO產生與否的腫瘤中5mC的水平。

6. 基因組范圍的甲基化分析：研究團隊通過氧化還原降低代表性亞硫酸氫鹽測序（oxRRBS）技術，對長期（10天）NO處理的TNBC細胞系進行了基因組范圍的5mC和5hmC分析，以確定NO對特定基因調控區域甲基化狀態的影響。

研究結果

1. NO抑制TET和ALKBH2酶活性：研究發現，生理濃度的NO能夠可逆地抑制TET和ALKBH2酶的活性。通過MALDI-TOF-MS檢測，研究團隊發現NO以濃度依賴的方式抑制了TET2酶對5mC的氧化，形成了5hmC。EPR光譜和DFT計算進一步證實了NO與非血紅素鐵原子的結合，形成了二亞硝基鐵復合體（DNIC）。

2. NO增加癌細胞和腫瘤中的5mC水平：細胞培養實驗顯示，外源性NO供體處理或內源性NO合成的癌細胞中，全局5mC和5hmC水平顯著增加。小鼠異種移植模型的結果也支持了這一發現，NO產生的腫瘤中5mC水平顯著高于NO合成被抑制的腫瘤。

3. NO調控特定基因調控區域的甲基化狀態：通過oxRRBS分析，研究團隊發現NO處理導致特定基因調控區域（如啟動子、基因體和增強子）的5mC和5hmC水平增加。這些變化與NO調控的腫瘤相關基因的表達改變相關。

4. NO介導的轉錄組變化與患者預后相關：RNA測序分析顯示，NO處理導致TNBC細胞系中數百個基因的轉錄水平顯著上調或下調。值得注意的是，這些NO調控的基因在NOS2表達的乳腺癌患者腫瘤中也表現出類似的表達變化，并且與患者預后不良相關。

本研究中，Epigentek品牌的P-1030和P-1032試劑盒被用于全局5mC和5hmC水平的定量分析。這些試劑盒基于酶聯免疫吸附測定（ELISA）原理，具有高靈敏度和特異性，能夠準確測量DNA樣本中5mC和5hmC的百分比含量。

P-1030試劑盒：用于檢測DNA樣本中的全局5mC水平。通過特異性抗體識別并結合5mC，該試劑盒能夠提供DNA甲基化狀態的直接量化指標，有助于研究DNA甲基化在基因表達調控、細胞分化、疾病發生發展等過程中的作用。

P-1032試劑盒：專門用于檢測DNA樣本中的5hmC水平。5hmC作為TET酶催化5mC氧化的中間產物，在DNA去甲基化過程中發揮重要作用。P-1032試劑盒能夠精確測量5hmC的含量，為研究TET酶活性、DNA去甲基化機制以及相關疾病提供重要信息。