用于同時(shí)檢測(cè)用FITC、生物素和地高辛標(biāo)記的兩種不同分析物（蛋白質(zhì)、基因組擴(kuò)增產(chǎn)物）的通用側(cè)流式試紙條

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一、符號(hào)解釋

二、警告和注意事項(xiàng)

1.所有試劑應(yīng)在原始容器中存放在 2-8 ℃的環(huán)境中。

2.使用前，將所有試劑恢復(fù)至室溫（18-28 ℃）。

3.必須遵守所有組分的有效期限。

4.保護(hù)檢測(cè)條免受濕氣影響；容器必須始終密封。

5.只接觸和標(biāo)記檢測(cè)條的箔紙覆蓋區(qū)域（標(biāo)記區(qū)域）。

6.廢棄物的處理必須按照當(dāng)?shù)氐姆ㄒ?guī)進(jìn)行。

7.檢測(cè)緩沖液含有抗微生物試劑，因此避免與皮膚和/或黏膜接觸。

8.適用于專業(yè)用戶。

三、預(yù)期用途

HybriDetect 2T是一種通用側(cè)流式試紙條，用于同時(shí)檢測(cè)用FITC、生物素和地高辛標(biāo)記的兩種不同分析物（蛋白質(zhì)、基因組擴(kuò)增產(chǎn)物）。  

它是一個(gè)開發(fā)平臺(tái)。它是一個(gè)開發(fā)平臺(tái)。

該測(cè)試僅供研究使用，不用于診斷目的。

四、提供的材料、儲(chǔ)存和穩(wěn)定性

可根據(jù)要求或從公司網(wǎng)站（www.milenia-biotec.de）獲取材料安全數(shù)據(jù)表（MSDS）。

五、所需材料（不包括在內(nèi)）

1、移液管

2、移液管尖（含有PCR的保護(hù)性過濾器）

3、反應(yīng)管或96孔微孔板

六、必要的開發(fā)工作-開發(fā)平臺(tái)

開發(fā)一個(gè)含有兩種不同標(biāo)記的探針用于分析物的溶液。以下條件是必要的：

1）溶液A：探針必須標(biāo)記為：

·FITC（異硫氰酸熒光素）或FAM（羧基熒光素）

·生物素

2）溶液B：探針必須標(biāo)記為：

·FITC（異硫氰酸熒光素）或FAM（羧基熒光素）

·地高辛

3）在檢測(cè)過程中使用約100 uL的液體（樣品和分析物特異性溶液A和B）。

4）提供的緩沖液（MGCBB）可用作這些分析物特異性溶液的基礎(chǔ)緩沖液。

使用示例：

20微升樣品和80微升特定于分析物的溶液，孵育時(shí)間為5分鐘。

注意：

1、體積、特定于分析物的溶液和孵育時(shí)間是個(gè)體測(cè)試開發(fā)的一部分。  

2、關(guān)于基因組擴(kuò)增物的檢測(cè)的基本步驟在第7頁(yè)上解釋：“PCR產(chǎn)物的測(cè)定性能”。一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)該被生物素化，特異性雜交探針應(yīng)該標(biāo)記為FITC。第二個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)該標(biāo)記有地高辛，特異性雜交探針應(yīng)該標(biāo)記為FITC。可以使用各種擴(kuò)增方法（PCR或等溫?cái)U(kuò)增，如LAMP或RPA）。

七、方法：

Milenia HybriDetect 2T是一種即用型通用試紙條（浸漬棒），基于使用金顆粒的側(cè)流技術(shù)。該試紙條旨在開發(fā)用于同時(shí)檢測(cè)兩種不同分析物（如蛋白質(zhì)、抗體或基因擴(kuò)增）的定性或定量快速測(cè)試系統(tǒng)。用戶需要開發(fā)兩種特異性分析物溶液。溶液A：含有用FITC標(biāo)記的第一探針（例如抗體、抗原、特異性探針）和用生物素標(biāo)記的第二探針（例如抗體、引物）。溶液B：同樣含有用FITC標(biāo)記的第一探針（例如抗體、抗原、特異性探針）和用地高辛標(biāo)記的第二探針（例如抗體、引物）（請(qǐng)參閱第5頁(yè)的“通用測(cè)試原理”）。

待測(cè)樣品與開發(fā)的分析物特異性溶液混合后，將試紙條放入該溶液中。

用FITC和生物素標(biāo)記的分析物A復(fù)合物首先與試紙條的樣品施加區(qū)域中標(biāo)記有金的FITC特異性抗體結(jié)合。用FITC和地高辛標(biāo)記的分析物B復(fù)合物也與試紙條的該區(qū)域結(jié)合。毛細(xì)力使金復(fù)合物A和B擴(kuò)散到分析膜上。只有被捕獲的金顆粒分析物在溢出相應(yīng)測(cè)試帶（測(cè)試帶A-分析物A，測(cè)試帶B-分析物B）時(shí)，與固定的生物素配體分子結(jié)合，并隨時(shí)間生成紅藍(lán)色帶狀。未被捕獲的金顆粒流過控制帶，并被物種特異性抗體固定在那里。隨著孵育時(shí)間的增加，會(huì)形成一個(gè)顏色濃烈的控制帶。

八、測(cè)試原理 - 基因擴(kuò)增物檢測(cè)

測(cè)試原理 - 蛋白質(zhì)檢測(cè)

控制帶試紙（Control Band Dipstick）

無論如何，控制帶必須可見！

它是一個(gè)控制功能，不能用來評(píng)估測(cè)試帶結(jié)果的質(zhì)量。如果孵育期后控制帶不可見，結(jié)果無效！必須使用新的試紙重復(fù)測(cè)試！

十、PCR產(chǎn)物測(cè)定性能

1. 從容器中取出所需數(shù)量的試紙條并標(biāo)記它們。

2. 對(duì)于每個(gè)待分析的樣品，將100 uL HybriDetect測(cè)定緩沖液或個(gè)別開發(fā)的緩沖液移液到反應(yīng)管或微孔板的孔中。

3. 直接將5-10 uL的雜交產(chǎn)物移液到樣品施加區(qū)域，或者選擇將5-10 uL的雜交產(chǎn)物加入反應(yīng)管/孔中的溶液中。

4. 將試紙條的樣品施加區(qū)域放入溶液中，并以直立的姿勢(shì)孵育，例如5-15分鐘。

5. 孵育結(jié)束后，將試紙條從測(cè)定溶液中取出，并立即解讀測(cè)試結(jié)果。

注意：

如果需要更高的分析靈敏度，增加PCR產(chǎn)物的體積可能會(huì)有所幫助。體積、特定于分析物的溶液和孵育時(shí)間始終是個(gè)別測(cè)試開發(fā)的一部分。

十一、測(cè)定性能 "RPA產(chǎn)物"

1. 從容器中取出所需數(shù)量的試紙條并標(biāo)記它們。

2. 對(duì)于每個(gè)待分析的樣品，將80 uL HybriDetect測(cè)定緩沖液（MGCBB）移液至反應(yīng)管或微孔板的孔中。

3. 在RPA反應(yīng)后，用HybriDetect測(cè)定緩沖液（MGCBB）稀釋RPA反應(yīng)混合物1/50或1/25（用于更高的靈敏度），并直接加載10 ul至樣品施加區(qū)域。

4. 將已加載的試紙條的樣品施加區(qū)域放入準(zhǔn)備好的溶液中（參見第2點(diǎn)），并以直立姿勢(shì)孵育，例如5-15分鐘。

孵育結(jié)束后，將試紙條從測(cè)定溶液中取出，并解讀測(cè)試結(jié)果。

十二、結(jié)果解讀

應(yīng)用內(nèi)部PCR控制：

雖然生物素標(biāo)記的擴(kuò)增物A主要用于檢測(cè)特定目標(biāo)序列，但地高辛標(biāo)記的擴(kuò)增物B被提供作為內(nèi)部PCR擴(kuò)增控制。

十三、PCR故障排除

十四、PCR測(cè)定的靈敏度

Milenia HybriDetect 2T的分析靈敏度相當(dāng)于瓊脂糖凝膠電泳和隨后用溴化乙錠染色。不受PCR產(chǎn)物大小和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的影響，可以檢測(cè)到低至5 pg的DNA。

十五、文獻(xiàn)參考

Dai T, et al, Frontiers in Microbiology (2019); 10:1884.

Yang Y, et al, Virology Journal (2017), 14(1), 1–10.

Qi Y, et al, PLoS ONE (2018), 13(11).

Ahmed F A, et al, Scientific Reports (2018), 8(1).

Wu L, Parasites & Vectors (2019). 12(1),

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