當(dāng)細(xì)胞生物學(xué)家第一次發(fā)現(xiàn)可能有一種脂質(zhì)參與他們最喜歡的途徑時(shí)，這有點(diǎn)像在馬路對(duì)面找到一堵墻(就像當(dāng)脂質(zhì)學(xué)家在他們的路上找到一種蛋白質(zhì)一樣……)。

由于脂質(zhì)的不同性質(zhì)，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)家都害怕在他們的研究過(guò)程中不得不面對(duì)這種情況。好消息是，有一些簡(jiǎn)單的方法可以幫助克服這一障礙，使研究特定途徑中的脂質(zhì)變得更容易。在這里，我想介紹一些脂配體相互作用研究的分析和準(zhǔn)備工具。

1. 覆蓋試驗(yàn)Overlay assays-鑒定與給定蛋白質(zhì)相互作用的脂質(zhì)：

這些分析方法允許鑒定一種或多種脂質(zhì)與給定蛋白質(zhì)相互作用。

與Western-blot原理類似，它們的原理是在表面涂上各種類型的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)將與已知的蛋白質(zhì)接觸，這種蛋白質(zhì)將被標(biāo)記或抗體臨時(shí)檢測(cè)到。脂質(zhì)的載體通常是硝化纖維素膜(圖1)。與點(diǎn)印跡法一樣，需要優(yōu)化一些實(shí)驗(yàn)參數(shù)(如緩沖液、蛋白質(zhì)純化或蛋白質(zhì)濃度)。

當(dāng)可用蛋白質(zhì)的數(shù)量有限時(shí)，小的“覆蓋分析格式”可以用少于0.5 mg的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。這是一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)測(cè)試一種感興趣的蛋白質(zhì)對(duì)各種脂質(zhì)的結(jié)合能力!

為了檢查蛋白質(zhì)對(duì)各種類型的脂質(zhì)的相對(duì)親和力，硝基纖維素陣列被標(biāo)記為每種脂質(zhì)的梯度。幾個(gè)相同的陣列可以證明在測(cè)試單特異性或多特異性蛋白質(zhì)有用。該技術(shù)顯示出高特異性(圖2)，結(jié)果甚至比ELISA試劑盒更干凈，再次強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的必要性。

對(duì)于那些對(duì)膜不熟悉的人，或者正在研究大量蛋白質(zhì)的人，也可以使用聚苯乙烯板，用各種類型的脂質(zhì)共價(jià)涂覆(稱為COVA板)。用于高含量篩選的微陣列板格式允許您在單個(gè)板上測(cè)試具有不同脂質(zhì)的幾種蛋白質(zhì)(親和性)。平板的每孔都有9種不同的脂質(zhì)，用于檢測(cè)先前標(biāo)記或通過(guò)免疫檢測(cè)的蛋白質(zhì)。圖3所示的是一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(已知與兩種不同的脂質(zhì)相互作用)。對(duì)于前面介紹的設(shè)置，需要優(yōu)化蛋白質(zhì)濃度。

2. 下拉試驗(yàn)Pull-down assays-發(fā)現(xiàn)一種已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伙伴：

對(duì)于相反的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，當(dāng)您想要識(shí)別已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伴侶時(shí)，瓊脂糖為基礎(chǔ)的下拉試驗(yàn)等制備技術(shù)將是您的最佳選擇:

*瓊脂糖珠包被確定的脂質(zhì)可以被進(jìn)一步孵育與細(xì)胞裂解液，上清液，重組蛋白…

* 然后相互作用的復(fù)合體通過(guò)離心將它們拉下來(lái)。

它允許分離脂質(zhì)結(jié)合蛋白的數(shù)量適合進(jìn)一步鑒定和表征。它經(jīng)常與細(xì)胞裂解液一起用于“撈出”脂質(zhì)對(duì)偶物(圖4)。

3.漂浮試驗(yàn)Floatation assays-用于更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用

當(dāng)你在尋找更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用時(shí)，另一種基于脂質(zhì)富集脂質(zhì)體(用作脂質(zhì)/配體相互作用的基質(zhì)支持)的制備方法是可用的。

與GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超離心)類似，脂質(zhì)體預(yù)結(jié)合到脂質(zhì)配體上，將沿著超離心制備的葡萄糖梯度分成幾個(gè)部分分布(圖5)。

艾美捷科技為您推薦脂質(zhì)專家Echelon Biosciences的幾款覆蓋試驗(yàn)Overlay assay的脂質(zhì)互作工具：

①. PIP Strips – 研究磷脂酰肌醇(PI)與哪些蛋白互作：

PIP StripsTM是一種2 x 6 cm的疏水膜，包含8種磷脂和7種其他重要的生物脂類，每個(gè)斑點(diǎn)有100 pmol的脂類。通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)覆蓋實(shí)驗(yàn)來(lái)確定脂質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。這為研究人員提供了一種方便的方法來(lái)確定他們感興趣的蛋白質(zhì)是否與一種或多個(gè)結(jié)合的脂質(zhì)相互作用。

PIP Strips試紙條脂類與斑點(diǎn)分布：

②. PIP Array

 – 研究脂質(zhì)&蛋白互作靈敏度: 

通過(guò)前期PIP Strips篩選，我們可以確定目標(biāo)蛋白與8種磷酸肌醇及其它7種重要磷脂是否存現(xiàn)結(jié)合。如果目標(biāo)蛋白與8種磷酸肌醇存在結(jié)合，如何進(jìn)一步檢測(cè)其結(jié)合強(qiáng)度或者結(jié)合靈敏度呢?

PIP Array – Lipid-Protein Interaction Assay

PIP Array是一種4 x 5 cm的疏水膜，包含8種磷酸肌醇，提供7種含量的標(biāo)準(zhǔn)品：100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 pmol。通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)覆蓋實(shí)驗(yàn)來(lái)確定脂質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)度和靈敏度。

PIP Array，PIP脂質(zhì)蛋白結(jié)合芯片斑點(diǎn)分布：

③．Membrane Lipid Strips – 研究脂質(zhì)和哪些膜蛋白互作

Membrane Lipid Strips是一種2 * 6 cm的疏水膜試紙條，包含了細(xì)胞膜中常見(jiàn)的15種具有不同生物功能的重要脂質(zhì)，每種脂類含量均為100 pmol。通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)覆蓋實(shí)驗(yàn)（PLO）來(lái)確定脂質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。這為研究人員提供了一種方便的方法來(lái)確定他們感興趣的蛋白質(zhì)是否與一種或多個(gè)結(jié)合的脂質(zhì)相互作用。

脂膜試紙條Membrane Lipid Strips，斑點(diǎn)分布：