【前情回顧】ELISpot實驗指南：從入門到精通

外周血單個核細胞（PBMCs）至少在人樣本中，是ELISpot和FluoroSpot實驗中使用最廣泛的細胞類型。PBMCs可以通過密度梯度離心（例如使用Ficoll-Paque）輕松從血液中分離。分離后的細胞可以直接使用，也可以選擇進行冷凍保存，以便在后續(xù)時間點使用。這是一份關(guān)于如何最佳分離、冷凍和解凍PBMCs的詳細指南。

1. 外周血單個核細胞（PBMCs）的分離

對于全血的收集，市面上有各種帶有不同抗凝劑的采血管可供選擇。根據(jù)Mabtech的經(jīng)驗，使用檸檬酸鹽和肝素的采血管最適合用于ELISpot實驗。如果需要大量細胞，也可以從白細胞層（buffy coat）中制備PBMCs，白細胞層是在去除血漿和大部分紅細胞后得到的白細胞濃縮物。

自備材料：血液樣本（全血或白細胞層）；無菌的Ficoll-Paque；無菌的PBS或無血清培養(yǎng)基（例如RPMI 1640）；聚丙烯離心管：50ml和/或15ml，無菌；吸管和移液器；無菌巴氏吸管（塑料或玻璃）；自動移液器和無菌吸頭；室溫離心機

PBMCs的分離步驟：

1. 全血：用PBS將血液稀釋2倍（例如，10ml血液+10ml PBS）。白細胞層：白細胞層中的細胞密度比全血更高，因此需要稀釋更多（大約3倍）。  

2. 準備含有Ficoll-Paque的離心管。根據(jù)血液體積，選擇15ml管或50ml管。如果使用15ml管，加入5ml Ficoll-Paque；如果使用50ml管，加入15ml Ficoll-Paque。  

3. 小心地將稀釋后的血液輕輕加在Ficoll-Paque層的上方，避免破壞界面。對于15ml管，加入8ml稀釋后的血液；對于50ml管，加入25ml稀釋后的血液。**提示：** 在加樣時，將移液管靠在管壁上，并傾斜試管。  

4. 在室溫下，以400×g的速度離心30分鐘，離心過程中不使用制動。  

5. 離心后，在Ficoll-Paque層上方會形成一層白色至灰白色的單個核細胞層。小心地用巴氏吸管收集單個核細胞，并將其轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。或者，也可以先去除一部分血漿層，再收集單個核細胞。注意，不要將來自超過兩個Ficoll管的細胞合并，并且保持體積（不超過試管體積的一半）。用PBS或無血清培養(yǎng)基將新管加滿。  

6. 通過離心新管10分鐘（400×g）來洗滌細胞。  

7. 棄去上清液，重懸沉淀，并加入PBS或無血清培養(yǎng)基。**提示：** 在重懸細胞時，先輕敲試管使細胞沉淀變得不那么緊密。然后加入1-2ml緩沖液/培養(yǎng)基，緩慢上下吸打溶液，再將試管加滿。  

8. 通過離心新管10分鐘（400×g）來洗滌細胞。  

9. 棄去上清液，重懸沉淀，并加入無血清培養(yǎng)基。  

10. 記錄體積，并取少量樣本進行細胞計數(shù)。  

11. 以400×g的速度離心10分鐘來洗滌細胞。**提示：** 在這一步進行細胞計數(shù)。**提示：**經(jīng)過Ficoll分離后，可能會存在殘留的紅細胞（RBC）和粒細胞。如果需要，可以使用市售的試劑來去除這些細胞。（例如“RBC裂解緩沖液”和“粒細胞去除劑”）

12. 如果您想立即使用細胞，棄去上清液，通過輕輕上下吸打，用適量的細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀。PBMCs現(xiàn)在可以用于基于細胞的免疫分析，如ELISpot、FluoroSpot和流式細胞術(shù)。如果您想冷凍保存細胞，則可參考如下“PBMCs的冷凍保存”部分。

2. 外周血單個核細胞（PBMCs）的凍存

標記冷凍管，并確保冷凍容器已準備好。將細胞在室溫下長時間置于冷凍培養(yǎng)基中可能會對細胞活性產(chǎn)生負面影響。

自備材料：冷凍培養(yǎng)基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 20%胎牛血清（FCS）和10%二甲基亞砜（DMSO）。如果您的細胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，請使用7% DMSO； 冷凍管，例如1.8ml；聚丙烯離心管：50ml和/或15ml，無菌；冷凍容器，例如“CoolCell”或“Mr. Frosty”；自動移液器和無菌吸頭；-80℃冰箱；-150℃冰箱或液氮罐

PBMCs的凍存步驟：

1. 棄去上清液（來自前一部分的第11步），并將細胞用冷凍培養(yǎng)基稀釋至每毫升500萬到2500萬細胞的濃度。如果您使用的是無血清冷凍培養(yǎng)基，則應(yīng)將細胞濃度調(diào)整至每毫升100萬細胞。

2. 將細胞分裝至冷凍管中，例如每管1毫升，并將冷凍管轉(zhuǎn)移到冷凍容器中。確保通過持續(xù)重懸保持細胞處于懸浮狀態(tài)。 **提示：** 對于1.8毫升的冷凍管，每管分裝1毫升細胞懸浮液。對于其他尺寸的冷凍管，務(wù)必確保分裝的體積小于最大容量，因為液體在冷凍過程中會膨脹。

3. 迅速將冷凍容器放入-80℃冰箱中，至少保存4小時，最多保存1周。

4. 將冷凍管從冷凍容器轉(zhuǎn)移到-150℃冰箱或液氮罐中進行長期保存。

3. 外周血單個核細胞（PBMCs）的解凍

將水浴加熱至37℃。提前將用于第2步的細胞培養(yǎng)基預熱。在后續(xù)的洗滌步驟中使用的培養(yǎng)基保持室溫即可。

自備材料：細胞培養(yǎng)基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 10%胎牛血清（FCS）、10 mM HEPES、100 ug/ml青霉素+100 ug/ml鏈霉素；聚丙烯離心管：50ml和/或15ml，無菌；吸管和移液器；自動移液器和無菌吸頭；室溫離心機；37℃水浴；37℃、5% CO?培養(yǎng)箱

PBMCs的解凍步驟：

1. 迅速將冷凍管從冷凍保存處轉(zhuǎn)移到37℃水浴中，解凍細胞直到僅剩小冰晶。**提示：** 如果打算解凍多個冷凍管，每次只解凍幾個。冷凍培養(yǎng)基中含有DMSO，DMSO對細胞有毒，因此請盡快進行第2步。

2. 慢慢向冷凍管中加入0.5-1ml預熱的細胞培養(yǎng)基，重懸細胞，并將細胞從冷凍管轉(zhuǎn)移到15ml管中。用1ml細胞培養(yǎng)基沖洗冷凍管，并將其轉(zhuǎn)移到15ml管中。用細胞培養(yǎng)基將管子加滿。

3. 通過離心（300×g，10分鐘）洗滌細胞。

4. 棄去上清液，輕敲管子使沉淀變得不那么緊密。通過緩慢上下吸打，用1ml細胞培養(yǎng)基重懸細胞。加入細胞培養(yǎng)基，使總體積達到15ml。

5. 以300×g的速度離心10分鐘。

6. 棄去上清液，用1ml細胞培養(yǎng)基重懸沉淀。根據(jù)預期的細胞數(shù)量和所需的細胞濃度，加入額外的細胞培養(yǎng)基（例如5ml）。

7. 將細胞放入CO?培養(yǎng)箱中放置1小時。將蓋子稍微打開。**提示：**利用這一個小時的空閑時間來清洗和封閉你的ELISpot/FluoroSpot板。

8. 孵育（細胞靜置）后，重懸細胞并讓任何聚集的細胞碎片沉淀（大約需要1分鐘）。然后小心地將細胞懸浮液（不包括碎片）轉(zhuǎn)移到一個新的15ml管中。**提示：** 每個15ml管最多加入兩個冷凍管的細胞（或大約3000萬到4000萬細胞）。

9. 計數(shù)細胞并確定細胞活性。可以使用自動細胞計數(shù)器或通過顯微鏡使用臺盼藍染色來進行細胞計數(shù)。因為只有活細胞才能分泌分析物，所以在細胞計數(shù)時務(wù)必排除死細胞，如果可能的話，還要排除凋亡細胞。如果細胞濃度低于所需濃度，再次離心細胞，重懸并稀釋至所需的體積。

PBMCs細胞制備好后，即可準備進行ELISpot實驗。Mabtech作為ELISpot領(lǐng)域研究專家，可提供高品質(zhì)人的ELISpot試劑盒：