【介紹】

3D培養(yǎng)已成為在體外研究復(fù)雜系統(tǒng)（如腫瘤微環(huán)境（TME））的標(biāo)準(zhǔn)。這些系統(tǒng)有助于深入了解體內(nèi)發(fā)生的細(xì)胞與細(xì)胞相互作用和信息交流。使用3D基質(zhì)模擬復(fù)雜的TME（2），甚至開始模擬轉(zhuǎn)移（3），通過(guò)提供細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的成分并增強(qiáng)這些體外模型的生物學(xué)相關(guān)性（1，2）。傳統(tǒng)上，3D培養(yǎng)系統(tǒng)是在Matrigel 中建立的，它改變了癌癥體外研究的面貌，允許適當(dāng)?shù)募?xì)胞分化并組織成3D球體。盡管Matrigel系統(tǒng)的開發(fā)及時(shí)且具有創(chuàng)新性，但多年來(lái)遇到了多種并發(fā)癥（1，2）。其中包括批次間重現(xiàn)性困難，因?yàn)镸atrigel 的ECM成分可能不同，實(shí)驗(yàn)溫度控制困難，以及存在影響研究的生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)。有了更具重現(xiàn)性的系統(tǒng)，就有可能擴(kuò)展系統(tǒng)的復(fù)雜性并納入多種細(xì)胞類型，揭示關(guān)于細(xì)胞 -細(xì)胞相互作用/信號(hào)的信息（4）。這種對(duì)類似TME系統(tǒng)的深入了解將使研究人員能夠理解如何抑制甚至逆轉(zhuǎn)侵襲性癌癥的惡性表型（2）。因此，通過(guò)這個(gè)系統(tǒng)，對(duì)于開發(fā)一種可重現(xiàn)的、無(wú)動(dòng)物源的3D系統(tǒng)來(lái)研究TME的需求，有了一個(gè)答案。

VitroGel 3D系統(tǒng)已用于多種細(xì)胞系的持續(xù)培養(yǎng)（2），包括最近對(duì)PANC - 1的研究。開發(fā)胰腺癌新療法的z大挑戰(zhàn)之一是在2D培養(yǎng)中對(duì)治療的高反應(yīng)率，但在臨床上最終失敗。最近的工作揭示了在PANC - 1模型中3D球體形成所代表的體內(nèi)樣TME，當(dāng)比較2D和3D模型時(shí)，闡明了多種基質(zhì)蛋白、細(xì)胞代謝和對(duì)藥物治療反應(yīng)性的顯著改變（5）。結(jié)合我們對(duì)TME復(fù)雜性的理解，3D模型是在侵襲性和挑戰(zhàn)性模型（如PANC - 1）中進(jìn)行全面體外藥物評(píng)估的理想選擇。在這里介紹的研究中，VitroGel系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)允許均勻分布和球體形成，而沒(méi)有Matrigel或傳統(tǒng)水凝膠系統(tǒng)廣泛接受的警告，如支架結(jié)構(gòu)不良、不需要的蛋白質(zhì)/生長(zhǎng)因子、預(yù)凝膠溶液的不良pH或溫度、復(fù)雜的操作步驟和困難的下游分析（1）。VitroGel 3D為3D細(xì)胞培養(yǎng)及其他提供了更快、更簡(jiǎn)單和更通用的解決方案。VitroGel 3D是一種室溫穩(wěn)定、無(wú)動(dòng)物源、可調(diào)諧的水凝膠系統(tǒng)，緊密模擬ECM，允許細(xì)胞像在體內(nèi)一樣生長(zhǎng)。這個(gè)3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)置僅需20分鐘，包括10 - 15分鐘的等待時(shí)間，在此期間，水凝膠被激活并隨著含鈣或含鈉的細(xì)胞培養(yǎng)基的加入開始聚合。VitroGel 3D系統(tǒng)的多功能性允許進(jìn)行2D和3D細(xì)胞培養(yǎng)、安全的體內(nèi)使用以及通過(guò)系統(tǒng)的透明和可滲透性質(zhì)輕松進(jìn)行體外成像。此外，通過(guò)離心和移液可以輕松從VitroGel 3D系統(tǒng)中收集細(xì)胞，無(wú)需在細(xì)胞上使用降解酶。

【材料和方法】

VitroGel 3D - RGD細(xì)胞培養(yǎng)

為了評(píng)估在培養(yǎng)PANC - 1細(xì)胞時(shí)使用的水凝膠的適當(dāng)濃度，將VitroGel 3D - RGD水凝膠（TWG002，TheWell Bioscience）與0.5X PBS溶液以1:0、1:1或1:3的比例（v:v）制備。然后將稀釋的水凝膠溶液與PANC - 1細(xì)胞懸液（在含有10％FBS + 1x pen - strep的DMEM培養(yǎng)基中接種密度為5 x 10^5細(xì)胞/ mL）以4:1（水凝膠：細(xì)胞）的比例混合。將250?L的水凝膠 - 細(xì)胞混合物添加到24孔板的每個(gè)孔中，并在室溫下穩(wěn)定20分鐘。在固化步驟之后，將250?L完全細(xì)胞培養(yǎng)基添加到水凝膠的頂部。使用部分培養(yǎng)基更換方法以防止干擾水凝膠結(jié)構(gòu)：在第2天，不是去除覆蓋培養(yǎng)基，而是向水凝膠的頂部培養(yǎng)基中額外添加200?L完全細(xì)胞培養(yǎng)基，并將細(xì)胞培養(yǎng)額外24至48小時(shí)。在這個(gè)孵育期后，每隔一天應(yīng)更換水凝膠頂部60 - 70％的培養(yǎng)基。

活/死測(cè)定

8室蓋玻片載有125?L水凝膠和200?L覆蓋培養(yǎng)基。去除覆蓋培養(yǎng)基，并用PBS洗滌3次，然后按照制造商的方案使用LIVE/DEAD 細(xì)胞成像試劑盒（488/570）（ThermoFisher R37601）進(jìn)行活/死評(píng)估。然后使用共聚焦顯微鏡拍攝圖像。免疫熒光：這些切片按照上述在8室蓋玻片中制備（125?L水凝膠和200?L覆蓋培養(yǎng)基）。去除覆蓋培養(yǎng)基，并用PBS洗滌3次，然后按照制造商的方案使用Image - iT 固定/透化試劑盒、ActinGreen?488 ReadyProbes 試劑和NucBlue 固定細(xì)胞ReadyProbes 試劑（ThermoFisher）進(jìn)行固定和染色。然后使用Leica TCS SP8掃描共聚焦顯微鏡和z - stack功能捕獲圖像。使用LAS X軟件和ImageJ進(jìn)行圖像的處理和分析。

有關(guān)使用VitroGel 3D或VitroGel 3D - RGD系統(tǒng)的更多具體信息，請(qǐng)參考VitroGel用戶手冊(cè)（https://www.thewellbio.com/wp - content/uploads/2018/05/VitroGel - 3D - Protocol - Guidelines.pdf）。

【結(jié)果和討論】

PANC - 1細(xì)胞在0.5X PBS中以1:0、1:1和1:3的濃度遞增稀釋的水凝膠溶液中培養(yǎng)。在第1天（圖1，第1天），3D細(xì)胞培養(yǎng)在比例之間沒(méi)有顯示出差異；簡(jiǎn)單地說(shuō)，在每種條件下，細(xì)胞都能夠在水凝膠內(nèi)均勻分布（圖1）。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，基于水凝膠的濃度觀察到顯著差異（圖1，第7天）。在每種條件下，單個(gè)細(xì)胞形成集落并聚集，然而，水凝膠與PBS的1:1和1:3稀釋比允許單個(gè)細(xì)胞更快地分裂和擴(kuò)展，形成更大的3D集落，如圖1所示，其中藍(lán)色核比其他兩種條件下更多。

圖1：第1天（左）和第7天（右）PANC - 1細(xì)胞在VitroGel 3D - RGD的三種不同稀釋度下的代表性熒光顯微照片，以及相應(yīng)的抗體染色：NucBlue（核）和ActinGreen（肌動(dòng)蛋白）。

3D培養(yǎng)系統(tǒng)的另一個(gè)關(guān)鍵組成部分來(lái)自于ECM的發(fā)展，它可以重現(xiàn)體內(nèi)所見(jiàn)。在圖2中查看ActinGreen / NucBlue染色的放大視圖，揭示了在VitroGel 3D - RGD水凝膠中維持的PANC - 1細(xì)胞的細(xì)胞 - 細(xì)胞接觸所產(chǎn)生的ECM的復(fù)雜性和分散性增加。這些結(jié)果表明，在1:3稀釋的水凝膠中，PANC - 1 3D球體的生長(zhǎng)速率和復(fù)雜性高于1:0和1:1水凝膠稀釋度（圖2）。

圖2：第7天PANC - 1細(xì)胞在VitroGel 3D - RGD的三種不同稀釋度下的代表性和放大（底部）熒光顯微照片，以及相應(yīng)的抗體染色：NucBlue（核）和ActinGreen（肌動(dòng)蛋白）。

培養(yǎng)3D球體的一個(gè)擔(dān)憂來(lái)自于球體中心可能會(huì)壞死的觀念（6）。在這項(xiàng)研究中，用活/死測(cè)定評(píng)估球體。該評(píng)估顯示在三種水凝膠稀釋度中均沒(méi)有顯著的死亡（圖3）。

圖3：在第7天，不同水凝膠強(qiáng)度濃度下的活/死測(cè)定，顯示活細(xì)胞為綠色，死細(xì)胞為紅色。

【結(jié)論】

VitroGel 3D - RGD系統(tǒng)是一種方便、時(shí)效高且成本低的系統(tǒng)，允許對(duì)在3D系統(tǒng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞的形態(tài)和行為進(jìn)行準(zhǔn)確和可重現(xiàn)的研究，而無(wú)需擔(dān)心溫度敏感性或額外的生物成分。評(píng)估VitroGel 3D - RGD系統(tǒng)與PANC - 1細(xì)胞的結(jié)果表明，對(duì)于這種細(xì)胞類型，用0.5X PBS稀釋水凝膠在檢查簇的大小和肌動(dòng)蛋白定位時(shí)產(chǎn)生了更強(qiáng)大的PANC - 1球體。這些有希望的結(jié)果是驗(yàn)證一個(gè)系統(tǒng)的第一步，該系統(tǒng)現(xiàn)在可以在藥物篩選研究中呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)展，并為臨床提供信息，可能為在體外使用3D測(cè)定法使用患者細(xì)胞來(lái)了解特定疾病如何對(duì)治療做出反應(yīng)提供了有希望的一步。

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