【介紹】

由于體外檢測在進行優(yōu)化和臨床前驗證時具有高通量功能和成本效益，因此在藥物發(fā)現(xiàn)應用中變得越來越受歡迎。三維（3D）培養(yǎng)檢測尤其受歡迎，因為與傳統(tǒng)的二維（2D）細胞培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)提供了更具生理相關性的環(huán)境（1 - 4）。比較研究表明，2D培養(yǎng)會失去組織特異性結構，導致機械和生化信號的改變，并中斷細胞-細胞或細胞-基質(zhì)的相互作用（5）。這些差異在藥物開發(fā)中變得極為重要。雖然許多藥物在2D培養(yǎng)中表現(xiàn)出成功，但這可能無法在體內(nèi)轉(zhuǎn)化，因為體內(nèi)絕大多數(shù)細胞的3D環(huán)境可能使藥物難以攻擊所有細胞（7）。

TheWell Biosciences的VitroGel 系統(tǒng)是一種可調(diào)諧的水凝膠系統(tǒng)，隨時可用。它可用于2D和3D系統(tǒng)，以及體外和體內(nèi)應用。水凝膠可根據(jù)VitroGel的濃度和細胞密度進行調(diào)整，以適應任何細胞類型，并可與任何培養(yǎng)基混合以生成支架。VitroGel系統(tǒng)已被用于為各種應用創(chuàng)建許多不同細胞類型的3D結構。例如，最近一項分析新型抗癌肽功效的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞在培養(yǎng)中與其他細胞形成球體群（6）。添加他們的新型肽導致球體破壞，表明它可以抑制不依賴粘附的細胞生長，這一結論在二維環(huán)境中可能無法闡明。

在這項研究中，我們評估了HCT116細胞在VitroGel系統(tǒng)中用于2D涂層、3D培養(yǎng)和藥物測試的活力和存活情況（8）。在這項研究中，使用了VitroGel 3D和VitroGel 3D - RGD（用于更好細胞粘附的RGD肽修飾水凝膠系統(tǒng)）。HCT116是一種人類結腸直腸癌細胞系，常用于結腸癌研究和治療藥物開發(fā)。這些研究確立了VitroGel系統(tǒng)作為一種可行的手段，用于使用HCT116細胞作為結直腸癌模型進行藥物開發(fā)的研究。

【材料和方法】

細胞培養(yǎng)

HCT116細胞在含有10％FBS和1x pen - strep的McCoy's 5a培養(yǎng)基中在T - 25培養(yǎng)瓶中維持培養(yǎng)。當培養(yǎng)物達到約80％匯合時進行傳代。對于3D細胞培養(yǎng)和藥物測試，使用VitroGel 3D - RGD（TWG002，TheWell Bioscience），對于2D培養(yǎng)，根據(jù)用戶手冊（8），使用VitroGel 3D（TWG001，TheWell Bioscience）和VitroGel 3D - RGD，如下所述。

2D涂層培養(yǎng)方法

將水凝膠溶液與1X PBS以1:1的比例混合，然后以每孔250?L轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板中。為了穩(wěn)定水凝膠，使其在室溫下靜置20分鐘。將細胞懸液（約150K至200K細胞/ mL，250?L/孔）添加到水凝膠的頂部。在第2天，向頂部培養(yǎng)基中額外添加200?L完全細胞培養(yǎng)基。此后，根據(jù)TheWell Bioscience用戶手冊（8）更換頂部培養(yǎng)基，每隔一天更換頂部培養(yǎng)基的60 - 70％。

3D培養(yǎng)方法

將水凝膠溶液與0.5X PBS溶液以1:0、1:1和1:2的比例（v/v）稀釋。將細胞懸液以2:1的比例混合（2mL稀釋的水凝膠溶液與1mL細胞懸液，最終細胞濃度：150K至200K細胞/ mL）。將水凝膠/細胞混合物以每孔250?L添加到24孔板中。然后將水凝膠在室溫下穩(wěn)定20分鐘。穩(wěn)定后，在水凝膠頂部添加250uL完全細胞培養(yǎng)基。在第2天，向頂部培養(yǎng)基中額外添加200?L完全細胞培養(yǎng)基。此后，根據(jù)TheWell Bioscience用戶手冊（8）更換培養(yǎng)基，每隔一天更換頂部培養(yǎng)基的60 - 70％。

藥物測試

將HCT116細胞以500K細胞/ mL的密度接種在VitroGel 3D - RGD（1:1 0.5X PBS稀釋，2:1混合）的腔室蓋玻片上，分別培養(yǎng)3天。在第4天，將抗癌藥物（5 - 氟尿嘧啶，Sigma）以0?M、10?M、25?M、50?M的濃度添加到2D和3D培養(yǎng)細胞的頂部。用藥物處理細胞3天。在第7天，去除頂部培養(yǎng)基，并根據(jù)制造商的說明進行活/死測定（Thermo Fisher R37601，LIVE/DEAD 細胞成像試劑盒）。使用Image J處理活/死染色的定量。

免疫熒光（IF）成像

對于IF成像，細胞在腔室蓋玻片中生長，代替24孔板。每個腔室容納125uL水凝膠/細胞混合物。根據(jù)制造商的方案，使用Image - iT 固定/透化試劑盒、ActinGreen?488 ReadyProbes 試劑和NucBlue 固定細胞ReadyProbes?試劑（ThermoFisher）對細胞進行固定和染色。使用具有z - stack功能的Leica TCS SP8掃描共聚焦顯微鏡拍攝圖像，并通過LAS X軟件和ImageJ進行處理。

【統(tǒng)計分析】

使用T檢驗進行統(tǒng)計，將藥物濃度與0?M作為對照進行比較。P值小于0.05被認為是顯著的（*），P值小于0.005非常具有統(tǒng)計學意義（**），P值小于0.001極其具有統(tǒng)計學意義（***）。

【結果】

HCT116細胞可以在2D涂層和3D VitroGel系統(tǒng)上生長

我們使用兩種版本的VitroGel系統(tǒng)評估HCT116細胞（圖1）：標準的VitroGel - 3D系統(tǒng)，適用于懸浮細胞，以及RGD修飾版本，其中包含RGD肽修飾，RGD肽存在于所有主要的細胞外基質(zhì)蛋白中，可以促進細胞對生物材料如凝膠的粘附（9）。在接種細胞后24小時和7天后再次對細胞進行評估。當使用2D涂層方法時，即在接種細胞之前讓VitroGel水凝膠凝固，細胞根據(jù)使用的VitroGel系統(tǒng)版本采用不同的形態(tài)。在VitroGel 3D中，細胞在24小時后獲得球形形狀，并繼續(xù)增大至7天。與標準的VitroGel 3D一樣，VitroGel 3D - RGD上的細胞在24小時后也開始形成球形細胞簇。然而，與標準水凝膠不同的是，細胞在7天后擴散，呈現(xiàn)出類似于在標準處理培養(yǎng)塑料上的2D培養(yǎng)的形態(tài)。當在VitroGel 3D - RGD系統(tǒng)中使用3D細胞培養(yǎng)方法時，即在水凝膠凝固之前將細胞接種到水凝膠中，發(fā)現(xiàn)HCT116細胞在水凝膠內(nèi)均勻分布。這個過程似乎開始得更慢；24小時后，細胞簇非常小，每個簇只有2 - 3個細胞。到第7天，簇生長成更小、更均勻大小的球體。

圖1 2D和3D VitroGel培養(yǎng)的細胞形態(tài)

水凝膠的強度會影響其機械性能，從而影響細胞在水凝膠中的活力和反應。我們分析了HCT116細胞在三種不同水凝膠強度（濃度）下的生長潛力（圖2）和活力（圖3）：1:0稀釋（主要是水凝膠）、1:1稀釋（水凝膠/ PBS）和1:2稀釋。7天后，1:1水凝膠稀釋允許形成大的集落，而其他稀釋僅允許形成具有異常形態(tài)的小細胞簇/集落。通過活/死測定分析細胞活力表明，盡管集落大小減小，但在任何水凝膠稀釋度下都沒有顯著的細胞死亡。盡管在1:0和1:2支架稀釋中的細胞沒有顯示出許多死亡標記，但它們的形態(tài)表明它們可能正在死亡，如果尚未死亡的話。在1:1稀釋中，細胞更多，盡管它們具有通常與細胞健康狀況不佳相關的更平坦的形態(tài)，但認為支架中允許增加的細胞 - 基質(zhì)相互作用阻止了在2D培養(yǎng)中使用的超低粘附板中看到的球體形態(tài)。這種形態(tài)可能表明良好的細胞 - 基質(zhì)相互作用，這可能有助于模擬體內(nèi)情況，并且還表明z佳的支架稀釋度是1:1支架：PBS。

圖2：HCT116細胞在不同水凝膠濃度下的3D細胞培養(yǎng)（底部顯示放大的細胞）。

圖3：HCT116細胞在不同水凝膠強度下的細胞活力。

VitroGel培養(yǎng)的HTC116細胞對5 - 氟尿嘧啶沒有顯著反應

5 - 氟尿嘧啶（5 - FU）是一種用于治療包括結腸癌在內(nèi)的多種癌癥的常見抗癌藥物。雖然它在結腸癌治療中取得了一些成功，但最近的一些研究指出，許多患者對5 - FU產(chǎn)生了耐藥性（10），其他研究發(fā)現(xiàn)5 - FU僅對具有錯配修復基因突變的一小部分結腸癌起作用（11）。使用傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)與3D培養(yǎng)系統(tǒng)對比測試5 - FU對HCT116細胞的作用表明，5 - FU的效果不顯著（圖4）。我們發(fā)現(xiàn)，在2D培養(yǎng)中，隨著藥物濃度從10?M增加到50?M，藥物效率增加。然而，在3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，在任何階段都沒有顯著的藥物效果。只有在50?M的情況下，才有任何明顯的效果，細胞集落的大小明顯減小。使用活/死測定對細胞死亡的定量表明，在2D培養(yǎng)中死亡細胞的水平增加，表明5 - FU在殺死癌細胞方面的有效性。然而，在3D培養(yǎng)中，在任何階段都沒有顯著水平的死亡細胞；直到50?M時幾乎不存在。使用ImageJ對活細胞的定量表明，隨著藥物濃度的增加，活細胞數(shù)量穩(wěn)步下降。然而，在3D培養(yǎng)中，這種下降并不存在。 

圖4. 用不同濃度的5 - FU處理后HCT116細胞的活力。P值小于0.05被認為是顯著的（*），P值小于0.005非常具有統(tǒng)計學意義（**），P值小于0.001極其具有統(tǒng)計學意義（***）

【討論】

基于這些結果，我們得出結論，VitroGel - 3D - RGD為傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)提供了一種可行的替代方案，用于藥物研究。雖然標準VitroGel系統(tǒng)上的2D涂層培養(yǎng)也采用球形形態(tài)，但集落主要是通過細胞簇的聚集而形成的，而不是從單個細胞分裂而來。通過2D培養(yǎng)形成的球體也比從3D培養(yǎng)衍生的球體大得多，這可能使得營養(yǎng)物質(zhì)和藥物難以滲透到外層細胞之外。

在3D細胞培養(yǎng)中，我們研究了細胞形態(tài)、生長和存活對不同水凝膠強度（水凝膠稀釋度）的響應。我們發(fā)現(xiàn)HCT116細胞生長存在最佳的凝膠強度：0.5X PBS與水凝膠等量。活/死測定的結果表明，細胞死亡沒有增加，這表明在較低和較高水凝膠稀釋度下細胞總數(shù)的減少是由于細胞與水凝膠的機械相互作用。先前的研究發(fā)現(xiàn)，活細胞的數(shù)量取決于基質(zhì)的硬度，而死細胞的數(shù)量與之無關，這表明水凝膠的硬度可以影響增殖（12, 13）。事實上，對肝細胞癌細胞進行的研究表明，基質(zhì)的機械性能不僅可以促進增殖，還可以調(diào)節(jié)化療反應（14）。

與圖2相關的上文中，我們觀察到不同3D支架剛度的簇的不同部分甚至簇之間的肌動蛋白水平存在差異。一些簇比其他簇具有更多的肌動蛋白，并且不同剛度的支架中肌動蛋白的定位也不同。雖然我們僅使用肌動蛋白來觀察簇的形態(tài)（即扁平與球形），但應該注意的是，有研究表明癌細胞在不同階段的肌動蛋白水平會波動（15）。在研究中，肌動蛋白作為形態(tài)標記物是有用的，因為它是一種穩(wěn)態(tài)基因，但它的實際功能與從收縮到細胞分裂和運動的多個細胞過程有關。一項研究發(fā)現(xiàn)，位于癌細胞前緣的肌動蛋白絲本質(zhì)上是可運動的，并且周轉(zhuǎn)率更高（16）。另一項研究發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白在癌前和惡性乳腺腫瘤細胞中都起著主要作用，首先通過控制細胞硬度促進增殖，然后通過細胞柔軟性允許侵襲（17）。不同支架剛度之間肌動蛋白定位和表達水平的變化以及表明癌細胞中肌動蛋白表達變化的研究表明，3D支架可以影響細胞的運動性。

因為細胞對基質(zhì)剛度的反應獨特，所以可能在實驗之前必須對每個細胞系進行優(yōu)化。然而，該系統(tǒng)在培養(yǎng)基兼容性方面提供的廣泛靈活性以及其在體外和體內(nèi)使用的潛力使VitroGel成為藥物測試的絕佳選擇，特別是對于腫瘤應用。

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