PARP是一種在DNA修復、轉錄、凋亡和免疫功能中發(fā)揮關鍵作用的酶。PARP-1招募合成DNA酶來激活DNA修復。PARP-2維持基因組穩(wěn)定性并修復DNA單鏈斷裂(SSB。PARP-1和PARP-2在DNA修復系統(tǒng)中具有相同的調節(jié)機制，但它們與DNA斷裂結合的機制不同。PARP抑制劑與PARP酶結合后，PARP蛋白會與DNA損傷位點結合形成PARP-DNA復合物而無法分離，這就造成了其他DNA修復蛋白無法參與修復過程，甚至會造成進一步形成DNA的雙鏈損傷，這就是制劑所造成的PARP Trap效應。由于PARP Trap對腫瘤細胞的具有更強的殺傷效應，因此，對抑制劑的PARP Trap能力檢測變的非常重要。  

迄今為止，四種PARP抑制劑(olaparib、rucaparib、niraparib和talazoparib)已獲得FDA批準用于各種適應癥，如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌患者。PARP抑制劑對PARP家族成員和PARP-DNA捕獲效力表現(xiàn)出不同的抑制作用。這些特性與獨特的安全性/有效性特征相關。 

近期，國際團隊在Molecular Cancer Therapeutics（AACR）在線發(fā)表了題為"Venadaparib Is a Novel and Selective PARP Inhibitor with Improved Physicochemical Properties, Efficacy, and Safety"的文章，合成了新型強效PARP抑制劑維那達帕利(Venadaparib，也稱為IDX-1197或NOV140101)，評估了Venadaparib對PARP酶、PAR形成和PARP捕獲活性的療效，以及對BRCA突變細胞株的生長抑制作用，還建立了體外和體內模型，以研究藥代動力學/藥效學、療效和毒性。Venadaparib將有望成為下一代PARP抑制劑。Venadaparib的療效和安全性的Ib/IIa期研究已經(jīng)啟動。  

艾美捷科技作為BPS Bioscience中國區(qū)代理，非常榮幸能夠作為供應商為該項研究提供高品質PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584），為生物醫(yī)學領域的科研探索貢獻一份力量。  

BPS Bioscience特別的PARPtrap檢測試劑盒，非常適用于藥物研發(fā)和高通量篩選應用中，篩選增強PARP/DNA固定能力的小分子化合物。

* 以上產(chǎn)品，均為熒光偏振測定法（fluorescence polarization, FP）

引用產(chǎn)品：

該項研究中使用了艾美捷科技代理的BPS Bioscience的PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584），用于檢測PARP1捕獲檢測。  

【實驗技術，延伸解讀】

① PARP trapping assay，PARP捕獲檢測試驗

Venadaparib對重組人PARP-1酶的DNA結合活性的影響是通過BPS Bioscience進行的體外酶活性測定來確定的。PARPtrap酶活性測定試劑盒（目錄號80584；BPS Bioscience）用于該測定。Venadaparib、olaparib、rucaparib、niraparib、talazoparib和veliparib在濃度范圍為0.000026至5μmol/L進行了檢測。根據(jù)制造商的說明進行酶反應后，使用激發(fā)波長為485nm和發(fā)射波長為528nm的M1000微孔板閱讀器（Tecan Infinite）測量了熒光信號。 

② Enzymatic assay against recombinant PARP enzymes，重組PARP酶的酶學檢測

venadaparib對重組人PARP酶（PARP-1、PARP-2、PARP-3、TNKS-1、TNKS-2、PARP-6、PARP-7、PARP-8、PARP-10、PARP-11、PARP-12、PARP-14和PARP-15，均采購自BPS Bioscience）進行了體外酶活性分析。Venadaparib在濃度范圍為0.000005至10μmol/L進行檢測。采用Synergy 2微孔板讀數(shù)儀（BioTek Instruments）測量了發(fā)光輸出。使用Prism 9（GraphPad Software）確定了IC50。 

【產(chǎn)品解讀】

PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584）

PARPtrap Assay Kit for PARP1旨在利用熒光偏振（FP）高通量篩選測定法測量PARP1/DNA復合物形成。PARP1以其DNA結合結構域而聞名。與DNA的結合激活PARP1，在NAD+存在的情況下，PARP1會對自身進行核糖基化（自動核糖基化），這導致核糖聚合物的負電荷積累，從而導致PARP1從DNA上解離。然而，在一些抑制劑的存在下，PARP仍然與DNA結合，這種現(xiàn)象稱為困擾。已經(jīng)證明，被困的PARP-DNA復合物對癌細胞具有高度毒性，因此這類抑制劑對癌癥治療可能是可取的。  

PARPtrap Assay Kit for PARP1的關鍵是熒光標記的寡核苷酸雙鏈。在未發(fā)生核糖基化的情況下，PARP1與熒光探針結合，形成大的復合物，并導致高度偏振光的發(fā)射。然而，在自動核糖基化后，PARP1從寡核苷酸雙鏈解離，然后自由旋轉，發(fā)射較少偏振光。添加PARP1抑制劑會導致PARP1被困在熒光寡核苷酸雙鏈中，并以劑量依賴的方式增加FP信號。 

PARPtrap Assay Kit for PARP1是一種熒光偏振均相分析法。FP信號是使用能夠測量熒光偏振的熒光微孔板讀數(shù)器來測量的。   

產(chǎn)品組分：（96次規(guī)格，為例）

實驗步驟（簡易漢化，請務必以英文原版說明書為準）：

• 所有樣本和對照應進行重復操作。

• 實驗應包括一個“空白”、一個“參考”，一個“低FP對照”和一個“高FP對照”。

1. 準備Master Mix（每孔20 ul）：N孔 x（6 μl 5倍PARPtrap測定緩沖液 + 1 ul 25 nM熒光標記的DNA + 13 μl蒸餾水）。例如，對于20個孔，準備：120 μl 5倍PARPtrap測定緩沖液 + 20 ul 25 nM熒光標記的DNA + 260 μl蒸餾水。

2. 通過將1份5倍PARPtrapTM測定緩沖液稀釋為4份蒸餾水，制備1倍PARPtrapTM測定緩沖液。只稀釋所需的試劑量。

3. 準備抑制劑溶液。

   如果抑制劑化合物溶解在DMSO中，將其在水中稀釋10倍，使得所有樣本中DMSO的最終濃度為1%。如果化合物溶解在除DMSO以外的稀釋劑中，請使用該稀釋劑制備對照稀釋劑溶液。

4. 準備酶： 在冰上解凍PARP1酶。簡短離心含有酶的管子，使其完全恢復管子中的全部內容。用1倍PARPtrap測定緩沖液稀釋酶至約0.5 ng/ul。

   注意：PARP1酶對凍結/解凍很敏感。避免多次凍結/解凍。雖然我們不建議這樣做，但如果不一次使用所有試劑孔，請計算所需的PARP1量，只稀釋足夠實驗所需的量，并將剩余的未稀釋PARP1酶分裝并儲存在-80°C。不要再次使用解凍的分裝液或稀釋的酶。

5. 按照下表向“高FP對照”，“低FP對照”，“測試抑制劑”和“參考”孔中加入反應的每個組分：

6. 向標記為“空白”的孔中加入12 ul 5倍PARPtrap測定緩沖液 + 28 ul蒸餾水 + 5 ul稀釋劑（例如DMSO 10%）。

   注意，“空白”包含反應的緩沖成分，但不包含熒光探針或PARP1酶。

   備注：

• 參考：一個缺乏PARP1的陰性對照，其中所有熒光DNA以自由形式存在，F(xiàn)P最低（與空白不同，空白中沒有熒光探針）。參考用于進行計算。

• 高FP對照：不添加NAD+的條件，因此所有與熒光DNA結合的PARP1不能發(fā)生核糖基化反應，仍與DNA結合，導致FP達到試劑盒允許的最大值。

• 低FP對照：在存在NAD+的情況下，所有與熒光DNA結合的PARP1都被允許發(fā)生核糖基化反應并與DNA解離，導致主要為自由DNA和低FP。這是在沒有抑制劑的情況下對應于最大PARP1核糖基化活性的條件。

• 測試抑制劑：FP將與抑制活性水平和結果陷阱在熒光核苷酸雙鏈上成正比增加。

• 稀釋劑溶液：與用于制備測試抑制劑的DMSO濃度相同，但不含抑制劑。

7. 室溫孵育30-60分鐘。

8. 向標記為“高FP對照”的孔中加入5 ul蒸餾水。

9. 向“空白”、“低FP對照”、“測試抑制劑”和“參考”孔中加入5 ul 10倍NAD+，啟動PARP1酶反應。不要向“高FP對照”中加入NAD+。 這將使最終反應體積達到50 ?l。 室溫孵育板子60分鐘。

10. 使用能夠在470-480 nm波長范圍內激發(fā)和在508-528 nm范圍內檢測發(fā)射光的微孔板讀數(shù)器讀取樣品的熒光極化值。

    從所有值中減去空白值。

References

1. Murai, J., et al. Molecular Cancer Therapeutics 2014. 13:433-443.

2. Murai, J., et. al. Cancer Research 2012. 72:5588-5599.

3. Zandarashvili, L., et al. Science 2020. 368(6486): eaax6367.

相關產(chǎn)品：

BPS Bioscience，激酶研究專家，活性酶、激酶活性/抑制劑篩選檢測試劑盒、慢病毒等，產(chǎn)品涉及臨床前藥物開發(fā)過程的每個階段，包括磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶（PARP）等熱門指標的蛋白酶及酶活/抑制劑篩選檢測試劑盒。詳情清咨詢艾美捷科技：http://m.zihai029.com/