DCFH-DA，2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（也稱為2'，5'-二氯熒光素二乙酸酯），被細胞酯酶水解成2'，7'-二氫二氯熒光素（也稱為2'，7'二氯熒光素），然后主要被H2O2氧化成2'。2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯可能對細胞內氧化應激期間可能增加的廣泛氧化反應有反應性。該探針廣泛用于監(jiān)測細胞氧化還原過程。

艾美捷AAT Bioquest-2’,7’-二氯四氟乙烷雙乙酸鹽：

貨號 15204

單位尺寸 25 毫克

分子量 487.29

溶劑 DMSO

激發(fā)（納米）505

發(fā)射（納米） 526

預期用途 僅用于研究（RUO）

儲存 冷凍（< -15°C）；盡量減少光照暴露

激發(fā) FITC濾光片組

發(fā)射 FITC濾光片組

推薦板 黑色壁，透明底部

儀器規(guī)格 FITC濾光片組

庫存溶液的準備：

除非另有說明，所有未使用的庫存溶液應在制備后分成單次使用的小份，并儲存在-20°C。避免反復凍融。

2',7'-二氯二氫熒光素二醋酸酯庫存溶液：

在DMSO中配制1-10 mM的工作溶液。注意：未使用的DMSO庫存溶液應分裝到單次使用的小瓶中，并儲存在-20°C。避光保存。

工作溶液的準備：

2',7'-二氯二氫熒光素二醋酸酯工作溶液：

在生理緩沖液如PBS、HBSS、HEPES緩沖液中配制1-10 ?M的工作溶液。注意：您的應用的最佳工作濃度必須通過實驗確定。

樣品實驗方案：

以下程序提供一般指導，并應根據(jù)您的特定應用進行修改。

從生長介質中取出細胞，將染料工作溶液加入細胞中，并在室溫或37°C下孵化細胞5至60分鐘。

去除染料工作溶液；用預熱的HBSS沖洗，并加入預熱的HBSS或生長介質，并在最佳溫度下孵化。最佳恢復時間可能有很大差異，因為一些細胞類型通常表現(xiàn)出低水平的酯酶活性。

在將細胞暴露于實驗誘導因素之前，確定加載細胞的樣本的基線熒光強度。6. 陰性對照應按以下方式評估：

檢查未染色細胞在綠色通道的自發(fā)熒光。

對于流式細胞術，確保細胞在染料加載和處理后前向和側向散射不變。細胞尺寸的變化可能與處理或毒性反應導致的起泡或收縮有關。

檢查有無誘導劑的染料和緩沖液/介質的無細胞混合物的熒光。在沒有細胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨時間熒光的逐漸增加可能與自發(fā)水解、大氣氧化和/或光誘導氧化有關。

檢查未經(jīng)處理（對照）的加載細胞的熒光，這些細胞一直在生長介質或簡單緩沖液中維持。在健康細胞中，氧自由基被細胞酶和/或天然抗氧化劑清除。在染料加載恢復期之后，健康細胞應表現(xiàn)出在實驗期間相對穩(wěn)定的低水平熒光；然而，可能觀察到熒光的逐漸增加（由于自氧化）或減少（由于細胞中染料的丟失或光漂白）。在沒有任何刺激或誘導的情況下，健康、未經(jīng)處理的細胞中熒光的突發(fā)可能表明細胞死亡的進展或其他氧化事件。

陽性對照可以用H2O2或叔丁基過氧化氫（TBHP）刺激至約100 ?M的最終濃度（根據(jù)細胞的敏感性和反應增減劑量）。

文獻參考：

Mitochondrial localization of reactive oxygen species by dihydrofluorescein probes

Authors: Diaz G, Liu S, Isola R, Diana A, Falchi AM.

Journal: Histochem Cell Biol (2003): 319

Kinetic analysis of fluorescein and dihydrofluorescein effluxes in tumour cells expressing the multidrug resistance protein, MRP1

Authors: Saengkhae C, Loetchutinat C, Garnier-Suillerot A.

Journal: Biochem Pharmacol (2003): 969

Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123

Authors: Hempel SL, Buettner GR, O'Malley YQ, Wessels DA, Flaherty DM.

Journal: Free Radic Biol Med (1999): 146

A rapid diagnostic test for the viability of early cattle and rabbit embryos using diacetyl-fluorescin

Authors: Schilling E, Dopke HH.

Journal: Naturwissenschaften (1978): 658

Determination of fluorescin sodium in ophthalmic solutions

Authors: Robertson EJ, Patel JA.

Journal: Am J Hosp Pharm (1968): 598

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