在神經(jīng)退行性疾病研究中，SARM1（含無(wú)菌α和TIR基序的蛋白1）正成為一個(gè)備受關(guān)注的藥物靶點(diǎn)。作為T(mén)oll/白細(xì)胞介素受體-1（TIR）家族的成員，SARM1具有ADP-核糖環(huán)化酶和NAD?糖水解酶活性，能夠?qū)AD?切割為ADPR（ADP-核糖）、cADPR和煙酰胺。該蛋白高表達(dá)于神經(jīng)元中，當(dāng)受到損傷或代謝應(yīng)激時(shí)，SARM1激活導(dǎo)致軸突內(nèi)NAD?耗竭，進(jìn)而觸發(fā)病理性軸突丟失——這一過(guò)程被稱為Wallerian變性。近年研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)SARM1基因的功能獲得性突變與肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）相關(guān)，而敲除或抑制SARM1活性則能在腦損傷或藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷模型中保護(hù)軸突。因此，開(kāi)發(fā)高效、可靠的SARM1活性檢測(cè)方法，對(duì)于篩選潛在抑制劑及機(jī)制研究至關(guān)重要。

由艾美捷代理的BPS Bioscience推出的SARM1 Fluorogenic Assay Kit (Hydrolase Activity)（貨號(hào)：78217），正是為滿足上述需求而設(shè)計(jì)的一整套熒光法檢測(cè)試劑盒。以下從核心原理、試劑盒組分、適用場(chǎng)景及操作要點(diǎn)等方面進(jìn)行詳細(xì)介紹。

圖1：測(cè)定原理。

SARM1的水解酶活性是通過(guò)監(jiān)測(cè)Etheno-NAD水解形成Etheno-ADPR+煙酰胺的過(guò)程來(lái)測(cè)量的。由于內(nèi)部猝滅作用，Etheno-NAD本身不具有熒光性。當(dāng)SARM1對(duì)其進(jìn)行水解時(shí)，會(huì)釋放出煙酰胺，從而使熒光信號(hào)增強(qiáng)，且熒光信號(hào)的增強(qiáng)與酶活性直接成正比。

一、檢測(cè)原理與核心優(yōu)勢(shì)

本試劑盒采用熒光底物N?-乙烯-NAD?（e-NAD），該底物為天然NAD?的類(lèi)似物。在重組人源SARM1酶（氨基酸28-724）的催化下，e-NAD被水解生成乙烯-ADP-核糖和煙酰胺。與天然反應(yīng)產(chǎn)物不同，乙烯-ADP-核糖在特定波長(zhǎng)激發(fā)下會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈熒光（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)約為300/410 nm）。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度的增加速率，即可直接反映SARM1的水解酶活性。

相較于傳統(tǒng)的HPLC或比色法，熒光法具有以下顯著優(yōu)勢(shì)：

實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：無(wú)需終止反應(yīng)，可連續(xù)讀取動(dòng)力學(xué)曲線。

靈敏度高：檢測(cè)下限可達(dá)亞微摩爾級(jí)別。

操作簡(jiǎn)便：均相“混合-讀取”模式，無(wú)需分離步驟。

高通量兼容：支持96孔和384孔板，適用于自動(dòng)化篩選。

二、試劑盒組分與存儲(chǔ)穩(wěn)定性

該試劑盒提供兩種規(guī)格（96次反應(yīng)或384次反應(yīng)），每個(gè)試劑盒包含以下核心組分：

重組人SARM1酶（28-724氨基酸，活性蛋白）

熒光底物e-NAD

SARM1檢測(cè)緩沖液

陽(yáng)性對(duì)照抑制劑DSRM-3716：用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系及計(jì)算抑制率

所有組分在收貨后按指示條件存儲(chǔ)（通常為-80°C），自收貨之日起6個(gè)月內(nèi)保持最佳性能。用戶需注意避免反復(fù)凍融，建議首次解凍后分裝保存。

三、適用應(yīng)用場(chǎng)景

本試劑盒主要面向兩大應(yīng)用方向：

1. 小分子抑制劑的篩選與IC50測(cè)定

在藥物發(fā)現(xiàn)流程中，研究者可通過(guò)本試劑盒對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行初篩，快速識(shí)別具有SARM1抑制活性的先導(dǎo)化合物。試劑盒提供的DSRM-3716可作為陽(yáng)性對(duì)照，便于計(jì)算待測(cè)化合物的相對(duì)抑制率。典型的384孔板篩選方案可在30分鐘內(nèi)完成酶反應(yīng)與讀數(shù)。

2. 酶動(dòng)力學(xué)研究

通過(guò)改變底物濃度或酶濃度，可測(cè)定SARM1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如K?、V???及k_cat。這對(duì)于理解突變體（如ALS相關(guān)突變）的催化特性或比較不同抑制劑的作用模式（競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性等）具有重要意義。

四、實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)要說(shuō)明

1. 試劑準(zhǔn)備：將SARM1酶、e-NAD底物及緩沖液置于冰上解凍，平衡至室溫。

2. 反應(yīng)體系構(gòu)建（以96孔板為例）：每孔加入適量SARM1酶（通常為0.5–2 μg）與檢測(cè)緩沖液，加入待測(cè)化合物或DMSO對(duì)照，預(yù)孵育5–10分鐘。

3. 啟動(dòng)反應(yīng)：加入e-NAD底物至終濃度（例如100 μM），立即置于熒光酶標(biāo)儀中讀數(shù)。

4. 數(shù)據(jù)采集：在激發(fā)300 nm/發(fā)射410 nm處，每1–2分鐘讀取一次，連續(xù)監(jiān)測(cè)30–60分鐘。反應(yīng)速率（RFU/min）與酶活性成正比。

5. 數(shù)據(jù)分析：將抑制劑組的初始速率與對(duì)照組比較，計(jì)算抑制率及IC??。

五、注意事項(xiàng)與配套建議

物種特異性：該試劑盒基于人源SARM1（hSARM1）設(shè)計(jì)，若研究小鼠或大鼠SARM1，需驗(yàn)證交叉反應(yīng)性。

底物穩(wěn)定性：e-NAD對(duì)光敏感，建議避光操作。

陽(yáng)性對(duì)照：首次使用強(qiáng)烈建議運(yùn)行DSRM-3716的劑量-響應(yīng)曲線，以確認(rèn)試劑盒及儀器狀態(tài)。

輔助材料：用戶需自行準(zhǔn)備黑色/不透明底部的96或384孔板、多通道移液器及具備動(dòng)力學(xué)讀數(shù)功能的熒光酶標(biāo)儀。

六、文獻(xiàn)參考

Marques M., et al., 2019 Oncogene 38 (12): 2177-2191.

James D. I., et al., 2016 ACS Chem Biol 11 (11): 3179-3190.

Drown B. S., et al., 2018 Cell Chem Bio 25 (12): 1562-1570.