在腫瘤治療領(lǐng)域，PARP抑制劑已取得顯著成功，其作用機制不僅在于抑制PARP酶的催化活性，更關(guān)鍵的是將PARP蛋白“捕獲”在DNA損傷位點，形成致命的PARP-DNA復合物，導致癌細胞死亡。然而，第一代PARP抑制劑主要靶向PARP1，對PARP2的選擇性及捕獲效應研究相對不足。隨著研究發(fā)現(xiàn)PARP2在前列腺癌等惡性腫瘤中過表達，并通過FOXA1/AR通路參與疾病進展，開發(fā)能夠特異性誘導PARP2-DNA捕獲的小分子抑制劑成為新的藥物發(fā)現(xiàn)方向。

由艾美捷代理的BPS Bioscience推出的PARPtrap Assay Kit for PARP2（貨號：78296），正是為高通量篩選和表征PARP2捕獲型抑制劑而設計的完整解決方案。該試劑盒采用熒光偏振（Fluorescence Polarization, FP）技術(shù)，在均相體系中實時檢測PARP2與DNA的結(jié)合狀態(tài)，可快速評估化合物促進PARP2-DNA復合物形成的能力。以下從檢測原理、試劑盒組分、應用場景及操作要點等方面進行詳細介紹。

圖1：測定原理。

SARM1的水解酶活性是通過監(jiān)測Etheno-NAD水解形成Etheno-ADPR+煙酰胺的過程來測量的。由于內(nèi)部猝滅作用，Etheno-NAD本身不具有熒光性。當被SARM1水解時，煙酰胺被釋放出來，導致熒光信號增強，且熒光信號的增強與酶活性直接成正比。

一、檢測原理：熒光偏振法監(jiān)測PARP2-DNA相互作用

熒光偏振技術(shù)基于小分子在溶液中的旋轉(zhuǎn)速度與其分子量之間的關(guān)系。當熒光標記的小分子（如寡核苷酸探針）處于自由狀態(tài)時，旋轉(zhuǎn)速度快，發(fā)射光偏振程度低；當該分子與較大的蛋白質(zhì)（如PARP2）結(jié)合后，復合物旋轉(zhuǎn)速度減慢，發(fā)射光偏振程度顯著升高。

本試劑盒的核心設計如下：

1. 熒光標記的DNA雙鏈探針：提供一條末端帶有熒光基團（如FAM）的雙鏈寡核苷酸，模擬DNA損傷位點的結(jié)構(gòu)。

2. 重組人源PARP2酶（氨基酸2-583）：包含完整的DNA結(jié)合域及催化域，具有NAD?依賴性自身核糖基化活性。

3. NAD?：作為PARP2的底物，在未添加抑制劑時，PARP2結(jié)合DNA后會發(fā)生自身PARylation，負電荷積累導致其從DNA上解離。

4. 待測化合物：若化合物具有“捕獲”功能，則會阻止PARP2從DNA上解離，使其穩(wěn)定結(jié)合在DNA探針上。

檢測流程：將PARP2酶、熒光DNA探針、NAD?及待測化合物混合孵育。在無捕獲劑時，PARP2結(jié)合DNA后迅速發(fā)生自身修飾并解離，熒光偏振值較低；在存在捕獲型抑制劑時，PARP2被鎖定在DNA上，形成高分子量復合物，熒光偏振值顯著升高。通過測定偏振值（mP）的變化，即可量化化合物的捕獲活性。

二、試劑盒組分與規(guī)格

該試劑盒提供兩種規(guī)格：96孔板形式（100次反應）和384孔板形式（400次反應），每個試劑盒包含：

重組人PARP2酶（2-583氨基酸，純度及活性經(jīng)質(zhì)控驗證）

熒光標記的寡核苷酸雙鏈（避光保存）

NAD?（需按說明溶解使用）

PARPtrap 檢測緩沖液（優(yōu)化了離子強度及pH，確保最佳結(jié)合效率）

詳細操作說明書

所有組分在收貨后按指示存儲（通常為-80°C），自收貨之日起6個月內(nèi)保持最佳性能。熒光探針對光敏感，建議分裝后避光保存，避免反復凍融。

三、核心應用場景

本試劑盒主要面向兩大藥物發(fā)現(xiàn)需求：

1. 高通量篩選（HTS）促進PARP2-DNA捕獲的小分子

傳統(tǒng)的PARP酶活性抑制試驗僅能反映化合物對催化活性的抑制，無法區(qū)分“催化抑制”與“DNA捕獲”兩種機制。而PARPtrap試劑盒直接檢測PARP2-DNA復合物的穩(wěn)定性，可精準識別能夠增強而非破壞該復合物的化合物。這對于開發(fā)具有更強細胞毒性效應的下一代PARP抑制劑（如PARP2選擇性捕獲劑）至關(guān)重要。試劑盒兼容自動化移液工作站，384孔板格式支持每天數(shù)千個化合物的篩選。

2. 先導化合物的IC??測定及機制表征

對于篩選出的陽性化合物，可進一步進行劑量-響應曲線分析，計算其促進PARP2-DNA捕獲的半效濃度（EC??）或IC??。由于熒光偏振讀數(shù)穩(wěn)定、Z'因子高，該方法能夠可靠區(qū)分不同化合物之間的效力差異。研究者還可以通過改變NAD?濃度或DNA序列，探究化合物的作用模式（如是否與DNA結(jié)合位點競爭）。

四、實驗流程簡要說明

1. 試劑準備：將PARP2酶、熒光DNA探針、NAD?及檢測緩沖液置于冰上解凍，避光保存熒光探針。準備待測化合物（建議使用DMSO溶解，并設置濃度梯度）。

2. 反應體系構(gòu)建（384孔板推薦方案）：每孔加入10 uL檢測緩沖液，隨后加入2 uL PARP2酶（終濃度優(yōu)化范圍為10–100 nM），2 uL熒光DNA探針（終濃度5–20 nM），2 uL NAD?（終濃度100 uM），以及2 uL待測化合物或DMSO對照。總體積調(diào)整至20 uL。

3. 孵育與讀數(shù)：室溫避光孵育30–60分鐘。使用熒光偏振酶標儀，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm，分別測量平行偏振（S）和垂直偏振（P）信號，計算偏振值mP = 1000 × (S - G×P)/(S + G×P)，其中G為儀器校正因子。

4. 數(shù)據(jù)分析：將化合物孔的mP值與陰性對照（無化合物，PARP2正常解離）及陽性對照（使用已知捕獲型抑制劑，如奧拉帕尼或特定PARP2工具化合物）進行比較。捕獲活性% = (mP_compound - mP_min) / (mP_max - mP_min) × 100%，繪制劑量-響應曲線擬合EC50。

五、注意事項與配套建議

物種特異性：試劑盒提供人源PARP2重組蛋白，其DNA結(jié)合域與嚙齒類動物同源性較高，但跨物種驗證需用戶自行評估。

陽性對照：首次使用建議運行已知的PARP捕獲劑（如talazoparib，雖主要靶向PARP1但對PARP2也有一定捕獲效應），以確認體系性能。

背景控制：無PARP2酶的孔作為空白對照，測定熒光探針的基礎(chǔ)偏振值。NAD?缺失的孔可反映最大結(jié)合信號（因無自身修飾解離）。

輔助設備：需要具備熒光偏振檢測模塊的多模式酶標儀，以及黑色、低自發(fā)熒光的384孔板。

干擾排除：某些化合物自身可能具有熒光或淬滅效應，建議設置“化合物+熒光探針（無酶）”對照孔，排除假陽性。

六、文獻參考

Murai J., et al., 2014 Molecular Cancer Therapeutics 13: 433-443

Murai J., et. al., 2012 Cancer Research 72: 5588-5599

Zandarashvili L., et al., 2020 Science 368(6486): 6367

Marques M., et al., 2019 Oncogene 38 (12): 2177-2191.