在腫瘤生物學(xué)研究中，轉(zhuǎn)錄失調(diào)是驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞增殖和耐藥的關(guān)鍵機(jī)制之一。CDK9（周期蛋白依賴性激酶9）作為正性轉(zhuǎn)錄延伸因子b（P-TEFb）復(fù)合物的催化亞基，與周期蛋白CyclinT共同調(diào)控RNA聚合酶II的C端結(jié)構(gòu)域磷酸化，從而控制基因轉(zhuǎn)錄延伸過程。多種癌基因（如MYC、雄激素受體AR等）的轉(zhuǎn)錄高度依賴CDK9-CyclinT復(fù)合物的活性。CDK9的過度活化與腫瘤發(fā)生及治療耐藥密切相關(guān)，因此靶向CDK9-CyclinT已成為抗癌藥物開發(fā)的熱點(diǎn)方向。近年來，除了傳統(tǒng)小分子抑制劑，靶向蛋白降解（PROTAC）技術(shù)也取得了突破——例如選擇性CDK9-CyclinT降解劑LL-K9-3在22RV1細(xì)胞中顯示出比親本抑制劑SNS032及PROTAC分子Thal-SNS032更強(qiáng)的降A(chǔ)R和cMyc效果。這些進(jìn)展凸顯了可靠、高效的CDK9激酶活性檢測方法在藥物發(fā)現(xiàn)中的重要性。

艾美捷代理BPS Bioscience推出的CDK9/CyclinT Kinase Assay Kit（貨號(hào)：79628），正是為滿足激酶抑制劑篩選和酶動(dòng)力學(xué)研究需求而設(shè)計(jì)的一套完整發(fā)光法檢測方案。該試劑盒采用Kinase-Glo Max作為檢測試劑，通過定量反應(yīng)后剩余ATP的含量來反映激酶活性，具有操作簡便、靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍寬及高通量兼容等突出優(yōu)勢。以下從檢測原理、試劑盒組分、操作流程、應(yīng)用場景及性能特點(diǎn)等方面進(jìn)行詳細(xì)介紹。

一、檢測原理：基于ATP消耗的發(fā)光法定量激酶活性

本試劑盒的核心檢測原理為“激酶反應(yīng)-剩余ATP檢測”偶聯(lián)法：

激酶反應(yīng)：在含有重組人源CDK9/CyclinT復(fù)合物、特定激酶底物（如組蛋白或合成肽段）及ATP的反應(yīng)體系中，CDK9/CyclinT催化底物磷酸化，同時(shí)將ATP轉(zhuǎn)化為ADP。反應(yīng)過程中ATP被持續(xù)消耗。

終止與檢測：反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，加入Kinase-Glo Max發(fā)光試劑。該試劑含有熱穩(wěn)定性熒光素酶及其底物熒光素。當(dāng)體系中存在剩余ATP時(shí)，熒光素酶催化熒光素氧化產(chǎn)生穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)。發(fā)光強(qiáng)度與ATP剩余量呈正比，與激酶活性呈反比。

信號(hào)轉(zhuǎn)換：在無激酶或激酶被完全抑制的情況下，ATP消耗最少，發(fā)光信號(hào)最高；反之，激酶活性越強(qiáng)，ATP消耗越多，發(fā)光信號(hào)越低。通過比較待測樣品孔與對(duì)照孔的發(fā)光值，即可計(jì)算激酶活性或抑制率。

這一檢測模式具有以下技術(shù)優(yōu)勢：均相（無需分離磷酸化產(chǎn)物）、高靈敏度（檢測低至亞微摩爾ATP）、寬動(dòng)態(tài)范圍（超過4個(gè)數(shù)量級(jí)）以及操作簡便（僅需“混合-孵育-讀數(shù)”三步）。與傳統(tǒng)放射性同位素法（如??P-ATP摻入）相比，避免了放射性危害和廢料處理問題；與熒光法相比，無需激發(fā)光源，不受化合物自發(fā)熒光干擾。

二、試劑盒組分與規(guī)格

該試劑盒提供兩種規(guī)格：96孔板形式（100次反應(yīng)）和384孔板形式（400次反應(yīng)），每個(gè)試劑盒包含以下核心組分：

重組人CDK9/CyclinT激酶：純化的活性復(fù)合物，經(jīng)質(zhì)控驗(yàn)證具有底物磷酸化活性。

激酶底物：適用于CDK9的底物，通常為含有特定絲氨酸/蘇氨酸殘基的合成肽段或全長蛋白。

ATP：高純度三磷酸腺苷，濃度經(jīng)標(biāo)定。

激酶檢測緩沖液：優(yōu)化pH及離子成分，維持激酶最佳活性。

Kinase-Glo Max 發(fā)光試劑：即用型，避光保存。

詳細(xì)操作說明書：包含推薦反應(yīng)體系、孵育時(shí)間及數(shù)據(jù)分析方法。

所有組分在收貨后按指示存儲(chǔ)（通常為-80°C），自收貨之日起6個(gè)月內(nèi)保持最佳性能。Kinase-Glo試劑需避免反復(fù)凍融，建議分裝后于-20°C避光保存。

三、實(shí)驗(yàn)流程簡要說明

以下為典型96孔板單次反應(yīng)的操作步驟（總體積50 uL）：

1. 試劑準(zhǔn)備

從-80°C取出CDK9/CyclinT激酶、底物、ATP及檢測緩沖液，置于冰上解凍。

平衡檢測緩沖液至室溫。Kinase-Glo試劑提前30分鐘取出平衡至室溫（避免反復(fù)加熱）。

準(zhǔn)備待測抑制劑：用DMSO或緩沖液稀釋至所需濃度（建議設(shè)置10個(gè)濃度梯度，2倍或3倍倍比稀釋）。注意最終DMSO濃度不得超過1%（詳見禁忌說明）。

2. 激酶反應(yīng)體系構(gòu)建

每孔加入10 uL檢測緩沖液。

加入2 uL待測抑制劑或?qū)φ眨―MSO/緩沖液/陽性對(duì)照如SNS032或LL-K9-3）。

加入5 uL CDK9/CyclinT激酶（推薦起始濃度0.5–10 nM，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化至消耗30–50% ATP）。

加入10 uL激酶底物（終濃度依說明書推薦，通常為0.1–1 ug/孔）。

加入3 uL ATP（終濃度通常為10–100 uM，接近或低于K?值以獲得最佳抑制靈敏度）。

用檢測緩沖液補(bǔ)足總體積至25 uL（具體體積以說明書為準(zhǔn)）。啟動(dòng)反應(yīng)。

3. 激酶反應(yīng)孵育

用封板膜覆蓋，室溫或30°C孵育30–60分鐘（使ATP消耗處于線性區(qū)間）。

4. 發(fā)光檢測

加入25 uL Kinase-Glo Max試劑（與反應(yīng)體系等體積）。

在搖床上混合1–2分鐘，室溫孵育10–30分鐘（使發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定）。

使用發(fā)光酶標(biāo)儀（讀板模式：終點(diǎn)法，積分時(shí)間0.5–1秒）讀取發(fā)光值（RLU）。

5. 數(shù)據(jù)分析

Dinaciclib抑制CDK9/CyclinT激酶活性。

四、應(yīng)用場景

本試劑盒主要面向以下兩大類核心應(yīng)用：

1. 小分子激酶抑制劑的篩選與IC50測定

2. 酶動(dòng)力學(xué)研究

五、性能特點(diǎn)與注意事項(xiàng)

線性范圍與Z'因子：在優(yōu)化條件下（激酶消耗30–50% ATP），Z'因子通常大于0.7，滿足高通量篩選對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠性的要求。信號(hào)窗口（信背比）通常>5倍。

DMSO耐受性：體系中DMSO終濃度不得超過1%（見Contraindications），否則會(huì)抑制激酶活性或干擾熒光素酶反應(yīng)。建議將化合物母液濃度配制成至少100×，加入反應(yīng)體系后稀釋至1%以下。

ATP濃度選擇：為篩選ATP競爭性抑制劑，建議使用接近或低于K?的ATP濃度（如10 uM）；為評(píng)估非競爭性抑制劑或進(jìn)行選擇性譜分析，可使用飽和ATP濃度（如1 mM）。用戶需根據(jù)研究目的調(diào)整。

反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化：首次使用應(yīng)進(jìn)行時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)，確保激酶反應(yīng)在線性區(qū)間內(nèi)（通常30–60分鐘）。過度反應(yīng)導(dǎo)致ATP耗盡，將無法區(qū)分抑制程度的差異。

陽性對(duì)照：建議使用已知CDK9抑制劑如SNS032、 flavopiridol或降解劑LL-K9-3作為陽性對(duì)照，驗(yàn)證體系性能。

化合物干擾排除：某些化合物可能抑制熒光素酶活性（“火螢光素酶抑制劑”）或淬滅發(fā)光信號(hào)。建議設(shè)置“化合物+Kinase-Glo（無激酶反應(yīng)體系）”對(duì)照，評(píng)估化合物對(duì)檢測試劑的直接影響。若存在干擾，需使用替代檢測方法（如放射性濾膜結(jié)合法）進(jìn)行交叉驗(yàn)證。

六、文獻(xiàn)參考

Napolitano G, et al., 2003 J Cell Physiol. 197(1):1-7.

Li J., et al., 2022 J Med Chem. 65(16):11034-11057.