在腫瘤免疫治療領域，靶向共刺激或共抑制受體已成為突破性策略。DR3（死亡受體3，也稱TNFRSF25）作為TNF受體超家族成員，主要在T細胞和NK細胞上表達。其配體TL1A（TNFSF15）則表達于單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及部分非免疫細胞。DR3與TL1A結(jié)合后，可調(diào)節(jié)效應細胞的增殖、活化、凋亡及趨化因子產(chǎn)生，在T細胞介導的免疫應答中發(fā)揮關鍵作用。近年研究表明，抑制DR3-TL1A相互作用在實體瘤治療中具有顯著的治療潛力。因此，開發(fā)能夠阻斷這一蛋白-蛋白相互作用的抑制劑（小分子或生物制劑）成為藥物發(fā)現(xiàn)的熱點方向。

由艾美捷代理BPS Bioscience推出的DR3:TL1A Inhibitor Screening Assay Kit（貨號：82241），正是為高通量篩選和表征DR3-TL1A相互作用抑制劑而設計的完整化學發(fā)光檢測方案。該試劑盒采用基于ELISA原理的競爭性或直接結(jié)合檢測模式，以96孔或384孔板形式運行，可快速評估化合物或抗體對DR3與TL1A結(jié)合的阻斷效果。以下從檢測原理、試劑盒組分、操作流程及應用場景等方面進行詳細介紹。

圖1：DR3:TL1A抑制劑篩選檢測試劑盒工作流程圖。

首先，將DR3涂覆在96孔板或384孔板上。接下來，將生物素化的TL1A與DR3一起孵育。最后，用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（HRP）處理板，然后加入HRP底物以產(chǎn)生化學發(fā)光。化學發(fā)光信號與DR3:TL1A的結(jié)合成比例

一、檢測原理：固相結(jié)合-化學發(fā)光讀出

本試劑盒采用固相蛋白-蛋白相互作用檢測模式，核心流程如下：

1. 配體包被：利用試劑盒提供的生物素標記TL1A蛋白（biotin-labeled TL1A，氨基酸72至C端），通過生物素-鏈霉親和素相互作用將其固定在預先包被鏈霉親和素的微孔板上。這一固定化過程保持了TL1A的天然構(gòu)象和結(jié)合活性。

2. 受體結(jié)合：加入純化的DR3蛋白（氨基酸25-199，即胞外結(jié)構(gòu)域），在優(yōu)化緩沖液中與固定的TL1A發(fā)生特異性結(jié)合。若體系中存在抑制劑（小分子或抗體），則會競爭性或變構(gòu)性地阻斷DR3與TL1A的相互作用，導致結(jié)合到板上的DR3量減少。

3. 信號檢測：洗滌去除未結(jié)合的DR3后，加入鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶（streptavidin-labeled HRP）。該酶通過鏈霉親和素與生物素化TL1A結(jié)合（不依賴DR3），因此信號強度理論上應與TL1A的包被量成正比。但為了檢測DR3的結(jié)合量，實際試劑盒中還需依賴額外的檢測抗體。根據(jù)BPS Bioscience同類產(chǎn)品設計慣例，該試劑盒包含抗DR3的一抗及HRP標記的二抗，或直接使用HRP標記的抗DR3抗體。用戶手冊會提供詳細步驟。最終加入化學發(fā)光底物，HRP催化產(chǎn)生光信號，光強度與結(jié)合在板上的DR3量呈正相關。

4. 數(shù)據(jù)解讀：抑制劑存在時，DR3結(jié)合減少，光信號降低；無抑制劑時信號最高。通過計算抑制率來評價化合物的阻斷效力。

二、試劑盒組分與規(guī)格

該試劑盒提供兩種規(guī)格：96孔板形式（100次反應）和384孔板形式（400次反應），每個試劑盒包含以下核心組分：

生物素標記的TL1A（biotin-labeled TL1A，氨基酸72至C端）

純化的人源DR3蛋白（氨基酸25-199）

鏈霉親和素標記的HRP（streptavidin-labeled HRP）

檢測緩沖液（經(jīng)優(yōu)化以維持蛋白穩(wěn)定性和結(jié)合特異性）

詳細操作說明書

此外，試劑盒中通常包含鏈霉親和素預包被的微孔板（未明確寫出，但根據(jù)“convenient 96-well or 384-well format”及同類產(chǎn)品慣例，板條已包含在內(nèi)）。所有組分在收貨后按指示存儲（建議-80°C），自收貨之日起6個月內(nèi)保持最佳性能。

三、應用場景

本試劑盒主要面向兩大藥物發(fā)現(xiàn)需求：

1. 小分子抑制劑或生物制劑的篩選

在藥物發(fā)現(xiàn)早期，研究者可使用該試劑盒對化合物庫或抗體文庫進行高通量篩選（HTS），快速識別能夠阻斷DR3-TL1A相互作用的候選分子。384孔板格式支持自動化工作站，每天可完成數(shù)千個樣品的初篩。檢測體系為均相（結(jié)合后洗滌），化學發(fā)光信號穩(wěn)定，Z'因子通常大于0.7，適合高置信度篩選。

2. 抑制劑的滴定與IC50測定

對于初篩獲得的陽性化合物，可進一步進行劑量-響應曲線分析。將待測樣品稀釋為8-12個濃度梯度，按相同流程檢測，計算每個濃度的抑制率，使用四參數(shù)邏輯回歸擬合IC??值。該方法同樣適用于抗體藥物的親和力排序及表位競爭分析。

四、實驗流程簡要說明

以下為典型96孔板操作流程：

1. 試劑準備：將所有組分從-80°C取出，置于冰上解凍。平衡檢測緩沖液至室溫。準備待測抑制劑稀釋系列（建議使用檢測緩沖液稀釋，保持DMSO終濃度≤1%）。

2. 包被：將生物素標記的TL1A用檢測緩沖液稀釋至推薦濃度（如0.5-2 ug/mL），每孔加入50 uL，用封板膜覆蓋，4°C過夜或室溫孵育2小時。或者使用預包被鏈霉親和素的板，直接加入生物素-TL1A室溫孵育1小時。

3. 洗滌：棄去包被液，每孔加入200 uL PBST，洗滌3次，每次振蕩30秒后棄去。

4. 抑制劑與DR3共孵育：每孔加入25 uL檢測緩沖液，然后加入25 uL稀釋的待測化合物（或?qū)φ湛准尤刖彌_液/已知抑制劑），最后加入25 uL DR3蛋白（終濃度需預實驗優(yōu)化）。室溫振蕩孵育1-2小時。

5. 檢測：洗滌3次后，加入鏈霉親和素-HRP（及抗DR3檢測抗體，按試劑盒說明稀釋），室溫孵育30-60分鐘。再次洗滌后，加入化學發(fā)光底物，立即在酶標儀上讀取發(fā)光值（積分時間100-500毫秒）。

6. 數(shù)據(jù)分析：計算抑制率% = (信號_max - 信號_sample) / (信號_max - 信號_min) × 100%，其中信號_max為無抑制劑對照孔，信號_min為無DR3或無TL1A的背景對照孔。使用GraphPad等軟件擬合IC??。

五、存儲穩(wěn)定性

該試劑盒所有組分在收貨后按指示溫度（通常為-80°C）儲存，自收貨之日起6個月內(nèi)性能穩(wěn)定。熒光標記物（如有）需避光保存。建議將生物素-TL1A和DR3蛋白分裝為單次使用量，避免反復凍融導致活性下降。

六、文獻參考

Xu, W. D., et al., 2022 Front. Immunol. 13: 1-10.

Zwolak, A., et al., 2022 Sci. Rep. 12(1): 20538.