雙特異性抗體（BsAbs）是具有針對不同抗原或同一抗原的不同表位的結合位點的抗體。它們由重鏈和輕鏈組成，需要適當?shù)逆溒ヅ洳拍馨l(fā)揮功效。為了提高鏈匹配和不同應用的機會，已經(jīng)開發(fā)了30多種不同的技術，如旋入孔、ART-Ig、BiTE（雙特異性細胞接合劑）等。由于其優(yōu)越的細胞毒性作用和較少的耐藥性發(fā)展，它們在治療癌癥和其他疾病方面獲得了關注。BsAbs可以作為免疫細胞-癌細胞的橋梁，增強免疫細胞的殺傷潛力。目前的BsAbs具有CD3、CD16或CD47作為結合結構域之一，并靶向CD19、PD-1、LAG-3、PSMA、間皮素或其他腫瘤抗原。B淋巴細胞抗原CD19（Cluster of Differentiation 19），也稱為B淋巴細胞表面抗原B4和CVID3C，是一種在濾泡樹突細胞和所有B系細胞中表達的跨膜蛋白，參與體液、抗原誘導和耐受反應的平衡。它在正常和腫瘤B細胞中的存在使其成為癌癥治療的一個有吸引力的靶點。Blinatumomab是一種CD19/CD3 BiTE，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于難治性或復發(fā)性B細胞前體ALL（急性淋巴細胞白血病）患者，目前正在考慮用于CLL（慢性淋巴細胞白血病）治療。靶向CD19和CD3的新BsAbs和格式的開發(fā)將繼續(xù)為患有CD19+neneneba癌癥類型的患者帶來益處。

BPS Bioscience品牌的雙特異性CD19:CD3橋接化學發(fā)光ELISA試劑盒（貨號：82764）是一種ELISA，旨在分析雙特異性抗體（BsAbs）橋接CD19（分化簇19）和CD3（分化簇3）的能力，以用于篩查和分析應用。該檢測試劑盒可以確定抗CD19-抗CD3雙特異性抗體是否同時結合兩個靶標并將CD19連接到CD3。雙特異性CD19:CD3橋接化學發(fā)光ELISA檢測試劑盒配有足夠的重組人CD19（氨基酸20-291）、含CD3的檢測試劑和用于100種酶反應的檢測緩沖液。該試劑盒還包括作為陽性對照的抗CD19-抗CD3雙特異性抗體。

圖1：雙特異性CD19:CD3橋接化學發(fā)光ELISA檢測試劑盒原理。

96孔板涂有CD19蛋白。涂覆后，將抗CD19-抗CD3雙特異性抗體加入優(yōu)化的測定緩沖液中。洗滌板以去除未結合的抗CD19-抗CD3雙特異性抗體。然后將平板與含CD3的檢測試劑一起孵育。最后，加入ELISA ECL底物以產(chǎn)生化學發(fā)光，可以使用化學發(fā)光讀數(shù)器進行測量。化學發(fā)光信號與橋接效率成正比。

應用

研究CD19:CD3復合物的形成并同時評估BsAbs與其雙抗原靶點的結合

用于藥物發(fā)現(xiàn)和高通量篩選（HTS）。

注：適用于人血清、細胞培養(yǎng)上清液和純化蛋白質(zhì)。

供應材料：

 *蛋白質(zhì)的濃度是特定批次的，將在試管上標明。

未提供但必需的材料：

測試樣本（純化的重組蛋白，人血清，細胞培養(yǎng)上清液）

1x PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）

PBST緩沖液（含0.05% Tween-20的1x PBS）

能夠讀取發(fā)光信號的微孔板讀取器

可調(diào)節(jié)的微量移液器和無菌吸頭

旋轉搖床

儲存條件：

當按照指示儲存材料時，本試劑盒從收到之日起至多6個月內(nèi)性能最佳。

安全：

本產(chǎn)品僅供研究使用，不用于人體或治療用途。本產(chǎn)品應被視為危險物品，吸入、與皮膚、眼睛、衣物接觸以及吞食都是有害的。

如果發(fā)生接觸，請徹底清洗。

禁忌：

本試劑盒與高達1%的DMSO兼容。

檢測協(xié)議：

所有樣本和對照應成對進行。

檢測應包括“空白”、“陽性對照”和“測試樣本”條件。

我們建議在使用過程中將稀釋的蛋白質(zhì)保持在冰上。

有關蛋白質(zhì)處理的詳細信息，請參閱蛋白質(zhì)常見問題解答（bpsbioscience.com）。

樣本收集、處理和儲存的變異可能導致樣本檢測結果的差異。

如果使用人血清或細胞培養(yǎng)上清液，我們建議在樣本準備和分析過程中使用LysA?蛋白酶抑制劑雞尾酒試劑盒（#82199）。

我們建議使用抗CD19-抗CD3雙特異性抗體（#101076）作為內(nèi)部對照。如果不對對照雙特異性抗體進行劑量反應曲線測試，我們建議將抗CD19-抗CD3雙特異性抗體以0.1X、1X和10X的EC50值進行測試，該值顯示在下面的驗證數(shù)據(jù)中。

有關如何準備試劑稀釋液的說明，請參閱連續(xù)稀釋協(xié)議（https://bpsbioscience.com/serial-dilution-protocol）。

步驟1：包被96孔板

在運行樣本的前一天包被板。

1. 在冰上解凍CD19。短暫離心含有蛋白質(zhì)的試管以恢復其全部內(nèi)容物。

2. 將CD19蛋白稀釋至2 ng/?l，使用1x PBS（每孔50 ?l）。

3. 向每個孔中加入50 ?l稀釋后的CD19。

4. 在4°C下過夜孵育。

5. 使用每孔200 ?l的PBST緩沖液洗板三次。

6. 將板輕敲在干凈的紙巾上以去除液體。

7. 通過向每個孔中加入200 ?l的阻斷緩沖液9來阻斷孔。

8. 在室溫（RT）下至少孵育90分鐘。

9. 使用每孔200 ?l的PBST緩沖液洗板三次。

10. 將板輕敲在干凈的紙巾上以去除液體。

步驟2：雙特異性橋接

1. 通過將5x PP-02檢測緩沖液與蒸餾水按1:5的比例稀釋，準備1x檢測緩沖液。

2. 準備稀釋后的抗CD19-抗CD3雙特異性抗體對照（對照雙特異性抗體）（每孔50 ?l）。

2.1 在冰上解凍抗CD19-抗CD3雙特異性抗體。短暫離心試管以恢復試管的全部內(nèi)容物。

2.2 為劑量反應曲線準備從40 ng/?l開始的抗CD19-抗CD3雙特異性抗體的連續(xù)稀釋，使用1x檢測緩沖液（每孔50 ?l）。

3. 向“陽性對照”孔中加入50 ?l稀釋后的抗CD19-抗CD3雙特異性抗體。

4. 使用1x檢測緩沖液準備感興趣生物樣品（測試樣本）的連續(xù)稀釋，以達到期望的最終濃度（每孔50 ?l）。

5. 向標記為“測試樣本”的孔中加入50 ?l的每個測試樣本。

6. 向“空白”孔中加入50 ?l的1x檢測緩沖液。

7. 在室溫下輕輕搖動板子孵育1小時。

8. 使用每孔200 ?l的PBST緩沖液洗板三次，然后將板子輕敲在干凈的紙巾上。

注：額外的阻斷可能會提高信噪比。如有必要，通過向每個孔中加入200 ?l的阻斷緩沖液9來阻斷孔，持續(xù)10分鐘。

9. 在冰上解凍含有CD3的檢測試劑。短暫離心含有蛋白質(zhì)的試管以恢復其全部內(nèi)容物。

10. 用阻斷緩沖液9將含有CD3的檢測試劑稀釋1000倍（每孔50 ?l）。

11. 向所有孔中加入50 ?l稀釋后的含有CD3的檢測試劑。

12. 在室溫下輕輕搖動板子孵育1小時。

13. 使用每孔200 ?l的PBST緩沖液洗板三次，然后將板子輕敲在干凈的紙巾上。

步驟3：檢測

1. 就在使用前，將ELISA ECL底物A和ELISA ECL底物B各1體積混合（每孔100 ?l的混合液）。

2. 向每個孔中加入100 ?l的混合液。

3. 立即在能夠讀取化學發(fā)光的發(fā)光計或微孔板讀取器中讀取板子。

4. 應該從所有其他值中減去“空白”值。

讀取化學發(fā)光

化學發(fā)光是由于化學反應而產(chǎn)生的光（發(fā)光）。檢測化學發(fā)光不需要選擇波長，因為使用的方法是基于發(fā)射光度測量，而不是發(fā)射光譜光度測量。

為了正確讀取化學發(fā)光，請確保板讀取器設置為LUMINESCENCE模式。典型的積分時間是1秒，板子移動后的延遲是100毫秒。在測量光發(fā)射時不要使用濾光片。對于Synergy 2 BioTek板讀取器的典型設置是：使用濾光輪上的“孔”位置；光學位置：頂部；讀取類型：終點。可以根據(jù)不含酶的對照實驗的發(fā)光度調(diào)整靈敏度（通常我們將這個值設置為100）。

示例結果：

圖1. 兩種不同的抗CD19-抗CD3雙特異性抗體同時結合其雙重抗原靶標的能力。

使用雙特異性CD19:CD3橋接化學發(fā)光ELISA試劑盒驗證了兩種針對CD19和CD3的BsAb（#101076和#100441）的橋接能力。使用Bio-Tek微孔板讀取器測量發(fā)光度。結果以橋接百分比表示，其中最大結合度設置為100%。

文獻參考：

Robinson H., et al., 2018 Blood 132 (5): 521-532.

Ma J., et al., 2021 Front Immunol. 12:626616.

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