一、產(chǎn)品概述

TopBP1（DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II結(jié)合蛋白1）是一種參與DNA拓?fù)錉顟B(tài)調(diào)控的關(guān)鍵蛋白。該蛋白通過其C末端區(qū)域與拓?fù)洚悩?gòu)酶IIβ（Topo IIβ）相互作用，在DNA復(fù)制、DNA損傷檢查點(diǎn)激活及細(xì)胞存活等多個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。TopBP1含有多個(gè)BRCA1 C末端（BRCT）結(jié)構(gòu)域，通過這些結(jié)構(gòu)域與多種蛋白相互作用。研究顯示，TopBP1可通過不依賴于Rb的機(jī)制與E2F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并抑制其活性，該過程涉及募集SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物中的Brg1和Brm蛋白。

本文介紹的由艾美捷代理Bethyl Laboratories推出的兔抗TopBP1親和純化抗體（貨號(hào)A300-111A）由美國(guó)生產(chǎn)，經(jīng)抗原親和純化，適用于小鼠及人源樣本的免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB）檢測(cè)。

二、核心規(guī)格參數(shù)

參數(shù) | 詳細(xì)信息

靶標(biāo) | TopBP1（DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II結(jié)合蛋白1）

反應(yīng)性 | 小鼠，人

應(yīng)用 | IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全I(xiàn)gG

免疫原 | 人TopBP1蛋白第1472位氨基酸至C末端區(qū)間

同型 | IgG

標(biāo)記 | 非偶聯(lián)

純度 | 抗原親和純化

抗原物種 | 人

濃度 | 1000 ug/ml

儲(chǔ)存條件 | 2 - 8 °C

保質(zhì)期 | 收貨后1年

緩沖液 | Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 7-8，含0.09%疊氮化鈉

三、免疫原與識(shí)別表位

本抗體采用表位特異性親和純化工藝制備。將針對(duì)TopBP1蛋白的特異性表位固定在固相支持物上，從抗血清中親和捕獲并純化特異性抗體。

A300-111A所識(shí)別的表位位于人TopBP1蛋白第1400位殘基至C末端（第1435位殘基）之間。編號(hào)依據(jù)NCBI參考序列NP_008958.1（GeneID 11073）。該區(qū)域位于TopBP1的C末端，鄰近其與拓?fù)洚悩?gòu)酶IIβ相互作用的結(jié)構(gòu)域。

四、濃度測(cè)定方法

免疫球蛋白濃度采用比爾定律測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)條件下，1 mg/mL IgG在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A280）為1.4。本抗體濃度為1000 ug/ml（即1 mg/ml），可直接按體積量取使用。

五、應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)條件

通用說(shuō)明

所有免疫印跡實(shí)驗(yàn)均采用5%脫脂牛奶-TBST作為封閉液及抗體稀釋液。一抗孵育條件為過夜孵育（推薦4°C）。

推薦稀釋比例與用量

應(yīng)用 | 推薦稀釋比例/用量

免疫沉淀（IP） | 6 ug/mg 裂解物

免疫印跡（WB） | 1:2000 - 1:10000

二抗選擇說(shuō)明

細(xì)胞裂解物免疫印跡：

使用山羊抗兔IgG重鏈和輕鏈抗體（貨號(hào)A120-101P）。該二抗可同時(shí)識(shí)別兔IgG的重鏈和輕鏈，適用于檢測(cè)總IgG信號(hào)。

免疫沉淀產(chǎn)物的免疫印跡：

使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體，并在封閉緩沖液中添加5%正常豬血清（貨號(hào)S100-020）。這一組合的設(shè)計(jì)目的是：免疫沉淀后，樣本經(jīng)變性處理會(huì)釋放抗體的重鏈（約55 kDa）和輕鏈（約25 kDa）。若使用識(shí)別重鏈和輕鏈的常規(guī)二抗，這些抗體片段會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的背景信號(hào)，可能掩蓋目標(biāo)蛋白（TopBP1分子量約170 kDa）的信號(hào)。采用輕鏈特異性二抗，只有輕鏈被檢測(cè)，重鏈信號(hào)不被放大，從而顯著降低背景干擾。添加正常豬血清可進(jìn)一步封閉非特異性結(jié)合。

六、產(chǎn)品使用與儲(chǔ)存

儲(chǔ)存注意事項(xiàng)

抗體應(yīng)儲(chǔ)存于2 - 8°C，請(qǐng)勿冷凍。反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體聚集和活性下降。緩沖液中含有0.09%疊氮化鈉作為防腐劑，可有效抑制微生物污染。

穩(wěn)定性與保質(zhì)期

自收貨之日起，在推薦的儲(chǔ)存條件下保質(zhì)期為1年。建議分裝為單次使用量?jī)?chǔ)存于2-8°C，避免反復(fù)開蓋引入污染。

七、應(yīng)用要點(diǎn)總結(jié)

1. 分子量提示：TopBP1的預(yù)測(cè)分子量約為170 kDa。在免疫印跡檢測(cè)中，建議使用4-12% Bis-Tris梯度凝膠或6-8% SDS-PAGE凝膠以獲得良好的分辨率。高分子量蛋白的轉(zhuǎn)膜條件需優(yōu)化（建議使用PVDF膜，濕轉(zhuǎn)條件：100V，90-120分鐘）。

2. 免疫沉淀用量：每mg細(xì)胞裂解蛋白使用6 ug抗體。若TopBP1表達(dá)水平較低（如在某些非轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中），可適當(dāng)增加抗體用量至8-10 ug/mg裂解物。建議同時(shí)使用同型對(duì)照兔IgG作為陰性對(duì)照。

3. 細(xì)胞裂解液選擇：TopBP1主要定位于細(xì)胞核，且與染色質(zhì)緊密結(jié)合。推薦使用含高鹽（如300-400 mM NaCl）和核酸酶的裂解緩沖液（如RIPA緩沖液或改良的ChIP裂解液），以充分釋放染色質(zhì)結(jié)合的TopBP1。

4. 跨物種驗(yàn)證：經(jīng)驗(yàn)證可識(shí)別小鼠和人源TopBP1蛋白。對(duì)于大鼠等其他物種，建議通過序列比對(duì)評(píng)估保守性后驗(yàn)證。

5. 功能研究?jī)r(jià)值：該抗體識(shí)別人TopBP1的C末端區(qū)域（1400-1435位氨基酸）。TopBP1通過其C末端與Topo IIβ相互作用，并通過BRCT結(jié)構(gòu)域參與DNA損傷檢查點(diǎn)激活（特別是ATR-Chk1通路）。本抗體適用于研究TopBP1在DNA復(fù)制應(yīng)激響應(yīng)、檢查點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的分子機(jī)制。