一、產(chǎn)品概述

由艾美捷代理Bethyl Laboratories推出的Bethyl 兔抗HIF1-α抗體，親和純化（貨號(hào)：A300-286A）為兔源抗人/小鼠HIF-1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha）蛋白C端區(qū)域（第775–826位氨基酸之間）的特異性多克隆抗體。HIF-1α是細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境的核心轉(zhuǎn)錄因子，與HIF-1β形成異源二聚體，激活數(shù)百種靶基因（如VEGF、EPO、GLUT1等）的表達(dá)，參與血管生成、代謝重編程、細(xì)胞存活及腫瘤進(jìn)展。常氧條件下HIF-1α被VHL泛素化降解；缺氧時(shí)穩(wěn)定入核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。本抗體經(jīng)抗原親和純化，適用于免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫熒光（ICC-IF）、免疫組化（IHC）、免疫沉淀（IP）及免疫印跡（WB）等多種應(yīng)用，是缺氧信號(hào)通路研究的關(guān)鍵工具。

二、詳細(xì)規(guī)格

參數(shù) | 規(guī)格

靶標(biāo) | HIF-1α（缺氧誘導(dǎo)因子1α）

反應(yīng)種屬 | 小鼠、人

應(yīng)用 | ICC-IF, IHC, IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全I(xiàn)gG

免疫原 | 人HIF-1α第776位至C端（第826位）之間的區(qū)域（Swiss-Prot Q16665）

抗體類型 | IgG

偶聯(lián)物 | 未偶聯(lián)

純度 | 抗原親和純化

抗原種屬 | 人

濃度 | 200 ug/ml

儲(chǔ)存溫度 | 2 - 8 °C

有效期 | 自收貨之日起1年

緩沖液 | Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA及0.09% 疊氮鈉

三、產(chǎn)品制備與質(zhì)量控制

本抗體采用固相載體固定的HIF-1α特異性C端表位進(jìn)行親和純化。免疫原對(duì)應(yīng)人HIF-1α（GeneID 3091，Swiss-Prot Q16665）第775至826位氨基酸區(qū)域，該序列在哺乳動(dòng)物中高度保守，且位于HIF-1α的C端反式激活結(jié)構(gòu)域（C-TAD）內(nèi)，可有效識(shí)別缺氧穩(wěn)定形式的全長(zhǎng)蛋白。抗體經(jīng)抗原親和層析后，免疫球蛋白濃度通過比爾定律測(cè)定（1 mg/ml IgG在280 nm處吸光度為1.4）。

每批次質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：

Western blot：在低氧處理（如1% O2、CoCl2或DFO處理）的人HeLa、HEK293或小鼠NIH/3T3細(xì)胞裂解液中，檢測(cè)到約100–120 kDa的特異性條帶（HIF-1α分子量約93 kDa，但由于脯氨酸羥基化及磷酸化修飾，電泳遷移率常顯示為100–120 kDa）；常氧對(duì)照樣品條帶極弱或缺失。

免疫沉淀：6 ug/mg裂解物可從缺氧細(xì)胞核提取物中有效富集HIF-1α，并檢測(cè)到與HIF-1β的共沉淀。

IHC/ICC-IF：缺氧處理的細(xì)胞或腫瘤組織切片呈現(xiàn)核內(nèi)或核漿聚集性染色，常氧組織背景極低。

四、推薦應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)條件

所有Western blot實(shí)驗(yàn)建議使用5%脫脂牛奶-TBST作為封閉液和抗體稀釋液，一抗孵育條件為4°C過夜。以下為各應(yīng)用的推薦起始條件：

應(yīng)用 | 推薦稀釋度/用量 | 備注

Western Blot (WB) | 1:2000 – 1:10000 | 檢測(cè)細(xì)胞裂解液時(shí)，二抗推薦山羊抗兔IgG（H+L）（貨號(hào)A120-101P）；檢測(cè)免疫沉淀物時(shí)，二抗建議使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體，并在封閉液中加入5%正常豬血清（貨號(hào)S100-020）以消除重鏈干擾。

Immunoprecipitation (IP) | 6 ug/mg 裂解物 | 每毫克總蛋白使用6 ul抗體（1 mg/ml濃度對(duì)應(yīng)6 ug）。推薦與Protein A/G磁珠或瓊脂糖珠孵育2–4小時(shí)或過夜。

Immunohistochemistry (IHC) | 1:100 – 1:500 | 對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織切片，必須進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)：使用枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），高壓鍋修復(fù)20分鐘。也可試用Tris-EDTA（pH 9.0），但pH 6.0效果更佳。

Immunocytochemistry/Immunofluorescence (ICC-IF) | 1:100 – 1:500 | 細(xì)胞爬片固定后（推薦4%甲醛），建議進(jìn)行抗原修復(fù)：同上用枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）高壓修復(fù)20分鐘，可顯著增強(qiáng)核信號(hào)。若不做修復(fù)，僅對(duì)低氧處理細(xì)胞也可能獲得信號(hào)，但修復(fù)可提高一致性。

五、儲(chǔ)存與穩(wěn)定性

儲(chǔ)存條件：2 - 8°C，嚴(yán)禁冷凍。冷凍會(huì)導(dǎo)致抗體聚集和背景升高。

有效期：自收貨之日起1年，在2-8°C未稀釋、避光保存。

運(yùn)輸條件：冰袋冷藏運(yùn)輸，收貨后請(qǐng)立即存放于2-8°C。

防腐劑：緩沖液含0.09%疊氮鈉，可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。注意：疊氮鈉會(huì)抑制HRP活性，若用于熒光檢測(cè)則無(wú)影響；如需去除，請(qǐng)使用脫鹽柱。

六、注意事項(xiàng)

1. 僅限科研使用：不得用于臨床診斷或治療。

2. 缺氧誘導(dǎo)是關(guān)鍵：檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)時(shí)，必須設(shè)置缺氧處理組或使用蛋白酶體抑制劑（如MG132），否則常氧下信號(hào)極低，易導(dǎo)致假陰性。

3. 樣品制備：細(xì)胞裂解液中需加入蛋白酶抑制劑混合物及去泛素化酶抑制劑（如NEM），防止HIF-1α降解。推薦在缺氧環(huán)境中直接裂解細(xì)胞。

4. 抗原修復(fù)必需：對(duì)于IHC/ICC-IF，石蠟切片或固定細(xì)胞必須進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)（枸櫞酸鹽pH 6.0，高壓20分鐘），否則核信號(hào)缺失。

5. 安全操作：疊氮鈉有毒，操作時(shí)請(qǐng)佩戴手套。廢液按有害物處理。

6. 對(duì)照設(shè)置：建議同時(shí)檢測(cè)常氧與缺氧樣本，以及使用HIF-1α siRNA敲低或VHL過表達(dá)細(xì)胞驗(yàn)證抗體特異性。

七、典型實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)期

Western Blot：在CoCl2（100 uM，4小時(shí)）或低氧（1% O?，6小時(shí)）處理的HeLa細(xì)胞裂解液中，1:5000稀釋抗體可檢測(cè)到約110 kDa的清晰條帶；常氧對(duì)照無(wú)條帶或極弱。

Immunoprecipitation：從缺氧處理的HEK293核提取物中，6 ug抗體/mg蛋白可沉淀HIF-1α，洗脫物WB檢測(cè)到預(yù)期條帶，同時(shí)可檢測(cè)到共沉淀的HIF-1β。

IHC：人腎透明細(xì)胞癌（常伴VHL失活，HIF-1α組成性穩(wěn)定）FFPE切片顯示彌漫性核強(qiáng)陽(yáng)性；癌旁正常腎組織核陰性。

ICC-IF：低氧處理的HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的核內(nèi)點(diǎn)狀或均質(zhì)熒光；常氧細(xì)胞僅微弱胞漿背景。