盡管FITC仍然是準(zhǔn)備綠色熒光生物偶聯(lián)物最受歡迎的熒光標(biāo)記染料，但FITC存在某些局限性，例如顯微鏡成像時(shí)的嚴(yán)重光漂白和pH敏感的熒光。與FITC等熒光素衍生物相比，使用iFluor? 488染料制備的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物要優(yōu)越得多。iFluor? 488偶聯(lián)物的亮度明顯高于熒光素偶聯(lián)物，并且更加光穩(wěn)定。此外，iFluor? 488的熒光不受pH（4-10）的影響。這種pH不敏感性是相對(duì)于只在pH高于9時(shí)才發(fā)出最大熒光的熒光素的一個(gè)重要改進(jìn)。iFluor? 488 SE染料相當(dāng)穩(wěn)定，并且顯示出與蛋白質(zhì)氨基基團(tuán)的良好反應(yīng)性和選擇性。這種iFluor? 488的光譜特性和反應(yīng)性與Alexa Fluor? 488 NHS酯（Alexa Fluor?是Invitrogen的商標(biāo)）相似。

艾美捷iFluor 488琥珀酰亞胺酯：

貨號(hào) AAT-1023

分子量：945.07

溶劑：DMSO

校正因子（260納米）：0.21

校正因子（280納米）：0.11

消光系數(shù)（cm -1 M -1）：750001

激發(fā)（納米）：491

發(fā)射（納米）：516

量子產(chǎn)率：0.91

預(yù)期用途 僅供研究使用（RUO）

儲(chǔ)存條件：冷凍（<-15°C）；盡量減少光照

庫(kù)存溶液的準(zhǔn)備：

除非另有說(shuō)明，所有未使用的庫(kù)存溶液應(yīng)在制備后分成單次使用的小份，并儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

蛋白質(zhì)庫(kù)存溶液（溶液A）：

將100 ?L的反應(yīng)緩沖液（例如，1 M 碳酸鈉溶液或pH約為8.5至9.0的1 M磷酸緩沖液）與900 ?L的目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液（例如，抗體，蛋白質(zhì)濃度>2 mg/mL如果可能的話）混合，得到1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記庫(kù)存溶液。

注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH應(yīng)為8.5 ± 0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，請(qǐng)使用1 M 碳酸鈉溶液或1 M pH 9.0磷酸緩沖液將pH調(diào)整到8.0-9.0的范圍。

注意：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在1X磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白質(zhì)是溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，必須對(duì)其進(jìn)行透析，以對(duì)抗1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和醋酸銨）。

注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的抗體將不會(huì)被很好地標(biāo)記。亞硝酸鈉或硫柳汞的存在也可能干擾偶聯(lián)反應(yīng)。亞硝酸鈉或硫柳汞可以通過(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱來(lái)去除，以獲得最佳的標(biāo)記結(jié)果。

注意：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg/mL，偶聯(lián)效率將顯著降低。建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg/mL，以獲得最佳的標(biāo)記效率。

iFluor? 488 SE庫(kù)存溶液（溶液B）：

將無(wú)水DMSO加入iFluor? 488 SE瓶中，制成10 mM庫(kù)存溶液。通過(guò)移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始偶聯(lián)之前準(zhǔn)備染料庫(kù)存溶液（溶液B）。請(qǐng)立即使用。染料庫(kù)存溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料活性。溶液B可以在避光和防潮的情況下冷凍保存兩周。避免凍融循環(huán)。

樣品實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

這個(gè)標(biāo)記協(xié)議是為山羊抗小鼠IgG與iFluor? 488 SE的偶聯(lián)而開發(fā)的。您可能需要為您特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。過(guò)度標(biāo)記蛋白質(zhì)可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比例的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物則靈敏度降低。

運(yùn)行偶聯(lián)反應(yīng)：

使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比例作為起點(diǎn)：將5 ?L的染料庫(kù)存溶液（溶液B，假設(shè)染料庫(kù)存溶液為10 mM）加入到蛋白質(zhì)溶液（95 ?L的溶液A）中，并有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL，蛋白質(zhì)的分子量約為200KD，則蛋白質(zhì)的濃度約為0.05 mM。

注意：我們建議使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比例。如果太低或太高，請(qǐng)分別確定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白質(zhì)比例。

繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

純化偶聯(lián)物：

以下是一個(gè)使用Sephadex G-25柱純化染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的示例協(xié)議。

根據(jù)制造商的說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25柱。

將反應(yīng)混合物（來(lái)自“運(yùn)行偶聯(lián)反應(yīng)”）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

一旦樣品運(yùn)行到樹脂表面頂部以下，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

向所需的樣品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱純化。合并包含所需染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的分?jǐn)?shù)。

注意：如果立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物必須用染色緩沖液稀釋，并分裝多次使用。

注意：對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

表征所需的染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物：

取代度（DOS）是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的最重要因素。較低DOS的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強(qiáng)度，但較高DOS的蛋白質(zhì)（例如，DOS>6）也傾向于熒光減少。對(duì)于大多數(shù)抗體，建議的最佳DOS在2到10之間，具體取決于染料和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。為了有效的標(biāo)記，應(yīng)該控制取代度，使每摩爾抗體有6-8摩爾的iFluor? 488 SE。以下步驟用于確定iFluor? 488 SE標(biāo)記蛋白質(zhì)的DOS。

測(cè)量吸收：

要測(cè)量染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的吸收光譜，建議保持樣品濃度在1-10 ?M的范圍內(nèi)，具體取決于染料的消光系數(shù)。

在280 nm和染料最大吸收（λmax = 490 nm對(duì)于iFluor? 488染料）處讀取OD（吸光度）

對(duì)于大多數(shù)分光光度計(jì)，需要將樣品（來(lái)自柱分?jǐn)?shù)）用去離子水稀釋，以便O.D.值在0.1到0.9的范圍內(nèi)。280 nm處的O.D.（吸光度）是蛋白質(zhì)的最大吸收，而490 nm是iFluor? 488 SE的最大吸收。為了獲得準(zhǔn)確的DOS，確保偶聯(lián)物中不含未偶聯(lián)的染料。

圖：用iFluor 488抗人CD24*HI45*綴合物染色的PBMC的流式細(xì)胞術(shù)分析。在iFluor 488特異性B2-A通道中使用Aurora光譜流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。