AAT Bioquest的iFluor染料針對蛋白質(zhì)標(biāo)記進(jìn)行了優(yōu)化，特別是抗體。這些染料亮度高、光穩(wěn)定，并且在蛋白質(zhì)上幾乎不發(fā)生猝滅。它們可以被熒光儀器的主要激光線很好地激發(fā)（例如，350、405、488、555和633納米）。iFluor 555染料的熒光激發(fā)和發(fā)射峰值分別約為~557納米和~570納米。iFluor 555系列的光譜特性與Cy3（Cy3是GE Healthcare的商標(biāo)）基本相同。與Cy3探針相比，iFluor 555試劑的熒光更強(qiáng)，光穩(wěn)定性更高。它們的熒光在pH 3至11范圍內(nèi)不受pH影響。這些光譜特性使得這一新的染料系列成為Cy3的優(yōu)越替代品。iFluor 555系列已成為Cy3和Alexa Fluor 555標(biāo)記染料（Cy3和Alexa Fluor是Invitrogen和GE Health Care的商標(biāo)）的優(yōu)秀替代品。iFluor 555 SE相當(dāng)穩(wěn)定，并顯示出與蛋白質(zhì)氨基基團(tuán)的良好反應(yīng)性和選擇性。

艾美捷iFluor 555琥珀酰亞胺酯：

貨號 AAT-71557

分子量：1125.26

溶劑：DMSO

校正因子（260納米）：0.23

校正因子（280納米）：0.14

消光系數(shù)（cm -1 M -1）：100000

激發(fā)（納米）：557

發(fā)射（納米）：570

量子產(chǎn)率：0.64

預(yù)期用途 僅供研究使用（RUO）

儲存條件：冷凍（<-15°C）；盡量減少光照

示例協(xié)議：

庫存溶液的準(zhǔn)備

除非另有說明，所有未使用的庫存溶液應(yīng)在制備后分成單次使用的小份，并儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

蛋白質(zhì)庫存溶液（溶液A）：

將100 ?L的反應(yīng)緩沖液（例如，1 M 碳酸鈉溶液或pH約9.0的1 M磷酸緩沖液）與900 ?L的目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液（例如抗體，蛋白質(zhì)濃度>2 mg/mL如果可能的話）混合，得到1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記庫存溶液。

注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH應(yīng)為8.5 ± 0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，請使用1 M 碳酸氫鈉溶液或1 M pH 9.0磷酸緩沖液將pH調(diào)整到8.0-9.0的范圍。

注意：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在1X磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白質(zhì)是溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，必須對其進(jìn)行透析，以對抗1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和醋酸銨）。

注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的抗體將不會被很好地標(biāo)記。亞硝酸鈉或硫柳汞的存在也可能干擾偶聯(lián)反應(yīng)。亞硝酸鈉或硫柳汞可以通過透析或旋轉(zhuǎn)柱來去除，以獲得最佳的標(biāo)記結(jié)果。

注意：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg/mL，偶聯(lián)效率將顯著降低。為了最佳的標(biāo)記效率，建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg/mL。

iFluor? 555 SE庫存溶液（溶液B）：

將無水DMSO加入iFluor? 555 SE瓶中，制成10 mM庫存溶液。通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始偶聯(lián)之前準(zhǔn)備染料庫存溶液（溶液B）。請立即使用。染料庫存溶液的長期儲存可能會降低染料活性。溶液B可以在避光和防潮的情況下冷凍保存兩周。避免凍融循環(huán)。

樣品實驗協(xié)議：

這個標(biāo)記協(xié)議是為山羊抗小鼠IgG與iFluor? 555 SE的偶聯(lián)而開發(fā)的。您可能需要為您特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。過度標(biāo)記蛋白質(zhì)可能會對其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比例的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物則靈敏度降低。

運行偶聯(lián)反應(yīng)：

使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比例作為起點：將5 ?L的染料庫存溶液（溶液B，假設(shè)染料庫存溶液是10 mM）加入到蛋白質(zhì)溶液（95 ?L的溶液A）中，并有效搖動。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL且蛋白質(zhì)的分子量約為200KD，則蛋白質(zhì)的濃度約為0.05 mM。

注意：我們建議使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比例。如果太低或太高，請分別確定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白質(zhì)比例。

繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物30-60分鐘。

純化偶聯(lián)物：

以下是一個使用Sephadex G-25柱純化染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的示例協(xié)議。

根據(jù)制造商的說明準(zhǔn)備Sephadex G-25柱。

將反應(yīng)混合物（來自“運行偶聯(lián)反應(yīng)”）加載到Sephadex G-25柱的頂部。

一旦樣品運行到樹脂表面頂部以下，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

向所需的樣品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱純化。合并包含所需染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的分?jǐn)?shù)。

注意：如果立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝多次使用。

注意：對于長期儲存，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

表征所需的染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物

取代度（DOS）是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的最重要因素。較低DOS的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強(qiáng)度，但較高DOS的蛋白質(zhì)也傾向于熒光減少。對于大多數(shù)抗體，建議的最佳DOS在2到10之間，具體取決于染料和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。為了有效的標(biāo)記，應(yīng)該控制取代度，使每摩爾抗體有5-8摩爾的iFluor? 555 SE。以下步驟用于確定iFluor? 555 SE標(biāo)記蛋白質(zhì)的DOS。

測量吸收：

要測量染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的吸收光譜，建議保持樣品濃度在1-10 ?M的范圍內(nèi)，具體取決于染料的消光系數(shù)。

在280 nm和染料最大吸收（λmax = 557 nm對于iFluor? 555染料）處讀取OD（吸光度）

對于大多數(shù)分光光度計，需要將樣品（來自柱分?jǐn)?shù)）用去離子水稀釋，以便OD值在0.1到0.9的范圍內(nèi)。280 nm處的OD（吸光度）是蛋白質(zhì)的最大吸收，而557 nm是iFluor? 555 SE的最大吸收。為了獲得準(zhǔn)確的DOS，確保偶聯(lián)物中不含未偶聯(lián)的染料。

圖：HeLa細(xì)胞分別與小鼠抗微管蛋白、AAT的iFluorTM 555山羊抗小鼠IgG偶聯(lián)物（紅色，右）或與Alexa Fluor555偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgGs（紅色，左）一起孵育。細(xì)胞核用Hoechst 33342（藍(lán)色，Cat#17530）染色。